第4部分單克隆抗體與基因工程抗體的制備

1、第4部分單克隆抗體與基因工程抗體的制備第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 一、雜交瘤技術(shù) 二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第二節(jié) 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性第三節(jié) 基因工程抗體制備 一、人源化抗體 二、小分子抗體 三、抗體融合蛋白 四、雙特異性抗體 五、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用 一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 二、蛋白質(zhì)的提純 三、小分子抗體的應(yīng)用 四、抗體融合蛋白的應(yīng)用 五、雙特異抗體的應(yīng)用 六、抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用和前景思考題小結(jié) 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使

2、免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體抗體種類：第一代抗體 多克隆抗體（polyclonal antibody)第二代抗體 單克隆抗體（monoclonal antibody)第三代抗體 基因工程抗體（genetic engineering antibody)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞 動(dòng) 物

3、：BALB/c小鼠712周齡20g25g體重（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：（12）107/只，不加佐劑，23周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠。淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞發(fā)育。漿細(xì)胞。抗原接種培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一

4、、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項(xiàng)：切忌過(guò)多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80或液氮及干冰中免疫脾細(xì)胞的制備：1108的淋巴細(xì)胞 無(wú)菌手術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過(guò)低不利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3)50% PEG 1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：251ml 50%的PEG（無(wú)菌，預(yù)溫37）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使

5、之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.51.5）105個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合1020天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥嘌呤 聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；HGPRT缺

6、乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O: HGPRT- ，TK-;長(zhǎng)命脾細(xì)胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+ ，TK+; 長(zhǎng)命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescence activated cell sorter）軟瓊脂平板法(soft agar method) 二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆

7、化培養(yǎng)與凍存特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.51個(gè)細(xì)胞有限稀釋法效率最高價(jià)格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細(xì)胞（15）x106/ml) + 細(xì)胞凍存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO )“慢凍”：分步冷凍，30-70液氮“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義 第二節(jié) 單克隆抗體的制備 經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代

8、易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。 一、單克隆抗體的產(chǎn)生動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法前5天進(jìn)行,預(yù)先腹腔注射pristane（15）106細(xì)胞13w形成腹水高滴度腹水可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞）二、單克隆抗體的純化ELISAELISA多頭加樣槍。免疫熒光法鹽析沉淀親和層析離子交換層析 McAb的純化 Ig類型、亞類測(cè)定：雙擴(kuò)法或EL

9、ISA法特異性測(cè)定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測(cè)定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示表位測(cè)定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測(cè)定：測(cè)定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用western blot三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對(duì)環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點(diǎn) ：在體外“永久”地存活并傳代用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于

10、體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療（二）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性局限性 ：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高 McAb PcAb 抗原要求 可以不純 純度高得量 高 低特異性 高 低 穩(wěn)定 低 高 沉淀反應(yīng) 無(wú) 有成本 高 低McAb與PcAb的比較McAb and PcAb第三節(jié) 基因工程抗體制備基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、

11、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。 將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體方法： 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點(diǎn)： 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（一）嵌合抗體嵌合抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的

12、鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療（二）改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：?jiǎn)捂溈勺儏^(qū)片段SdAb：?jiǎn)螀^(qū)抗體 二、小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白 許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體 分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過(guò)化學(xué)試劑交聯(lián)起來(lái)，然后分離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳

13、。化學(xué)交聯(lián)BsAb 將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。細(xì)胞工程BsAb 多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。基因工程BsAb定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這

14、一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性 五、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段?？贵w庫(kù)： 組合抗體文庫(kù)：在建庫(kù)過(guò)程中如果將VH和VL隨機(jī)組合 人天然抗體庫(kù)：抗體mRNA來(lái)源于未經(jīng)免疫的正常人（一）基本原理和程序噬菌體抗體庫(kù)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫(kù)的需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的I

15、g基因片段；構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫(kù)載體有噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(kù)(surface display antibody library)常用載體；表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫(kù)。通過(guò)多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。 構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)模擬天然全套抗體庫(kù)抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過(guò)1011庫(kù)容,能包含B細(xì)胞全部克隆建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性（二）噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)抗體庫(kù)的大容量抗體庫(kù)極高的篩選效率可

16、獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程所用的抗體基因又來(lái)自人體第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑蛋白質(zhì)的提純小分子抗體的應(yīng)用抗體融合蛋白的應(yīng)用雙特異抗體的應(yīng)用抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用和前景病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)腫瘤抗原的檢測(cè)免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測(cè)激素測(cè)定細(xì)胞因子的測(cè)定一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 病原體測(cè)定：肝炎病毒HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH弓形蟲,風(fēng)疹病毒,巨細(xì)胞病毒 ，單純皰疹病毒細(xì)胞表面CD測(cè)定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的測(cè)定：內(nèi)分泌疾病的診斷藥物測(cè)定(TDM)：抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛研究工作中的探針：越來(lái)越

17、多未知功能cDNA的克隆對(duì)復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加免疫沉淀二、蛋白質(zhì)的提純 單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。MACS定義： 分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段優(yōu)點(diǎn)：分子量小,穿透性強(qiáng),抗原性低不含F(xiàn)c段，不會(huì)與帶有Fc段受體的細(xì)胞結(jié)合，不良反應(yīng)少可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作半

18、衰期短，有利于及時(shí)中和及清除毒素三、小分子抗體的應(yīng)用 應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識(shí)別某一基因產(chǎn)物可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系腫瘤的體內(nèi)顯像診斷 單鏈抗體排除速度快，穿透力強(qiáng)，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高 放射顯像時(shí)，放射性核素排除較快，對(duì)身體危害程度小，顯像的本底較低 理想的顯像定位診斷載體病毒的診斷和抗病毒感染血液性疾病的診斷 白血病的免疫診斷及分型四、抗體融合蛋白的應(yīng)用在體外免疫檢測(cè)中的應(yīng)用 自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 快速檢測(cè)HBV和HIV病原體等 避免化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測(cè)的敏感度 用雙特異抗體作為二抗，檢測(cè)限達(dá)1ng/ml五、雙特異抗體的應(yīng)用在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應(yīng)用方法： 雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶抗原，一只臂結(jié)合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結(jié)合，利用二次導(dǎo)向系統(tǒng)顯示特點(diǎn)： 更高的的靈敏度和清晰度在體內(nèi)免疫治療中的應(yīng)用 抗體分子可與放射性核素、細(xì)胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結(jié)合靶分子后可提供重要輔助功能 雙功能抗體可有效針對(duì)低水平的腫瘤相關(guān)抗原，并將細(xì)胞毒物質(zhì)輸送到腫瘤細(xì)胞 抗體還可與攜帶藥物的脂質(zhì)體、各種PEG偶聯(lián)，從而增強(qiáng)體內(nèi)運(yùn)輸和藥代動(dòng)力學(xué)六、抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用和前景在腫