基因表達(dá)調(diào)控與重組DNA技術(shù)ppt課件

1、 第十三 - 十五章基因表達(dá)調(diào)控及重組DNA技術(shù)2主要內(nèi)容 基因及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念 原核基因表達(dá)調(diào)控基本原理 真核基因表達(dá)調(diào)控基本原理 重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 重組DNA技術(shù)基本原理 負(fù)載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子序列。 基因 （Gene）基因組（Genome） 來(lái)自一個(gè)遺傳體系的一整套遺傳信息原核：?jiǎn)蝹€(gè)環(huán)狀染色體所含的全部基因真核：一個(gè)生物體的染色體所包含的全部 DNA，又稱染色體基因組線粒體基因組葉綠體基因組Human Genome人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project, HGP） 1985年美國(guó)提出 計(jì)劃投入30億美元，1

2、5年完成 1990年正式啟動(dòng) 英、法、德、日、中國(guó)等先后加入中國(guó)的任務(wù)： 人類3號(hào)染色體短臂上一個(gè)約30Mb區(qū)域的測(cè)序， 該區(qū)域約占人類整個(gè)基因組的1。年10月 啟動(dòng)2000年 6月 完成草圖2001年 2月 nature公布草圖 Nature, 409 (6822): 860-921, 2001 2004年 10月 nature公布精度 99%的測(cè)序圖 人類基因數(shù)：2 - 2.5萬(wàn) Nature, 431 (7011): 931-945, 2004HGP的進(jìn)展The post-genome era is coming譜主為生物學(xué)大師耗資200萬(wàn)完成 盼未來(lái)降價(jià)普及 助提早預(yù)防疾病“ 生命天書(shū)

3、” 首份個(gè)人基因圖公布 (2007.5.30) James Waston 基因表達(dá)調(diào)控是指細(xì)胞生物接受環(huán)境信號(hào)刺激或適應(yīng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)供給狀況的變化，在基因表達(dá)水平上作出應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制。重組DNA技術(shù)本質(zhì)上是一項(xiàng)生物技術(shù)，目的在于通過(guò)人工重組DNA的方法，獲得某一目的基因的無(wú)性繁殖系DNA克隆，或使目的基因在一定的表達(dá)體系表達(dá)有特殊意義的蛋白質(zhì)。主要研究?jī)?nèi)容：基因表達(dá)方式、規(guī)律、調(diào)節(jié)機(jī)理10第一節(jié) 基因表達(dá)調(diào)控11一、基因表達(dá)的概念* 在各種調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，從基因激活開(kāi)始，經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程產(chǎn)生具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，從而賦予細(xì)胞一定的功能或表型，或使生物體獲得一定的遺傳性狀。 DNA R

4、NA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄簡(jiǎn)單定義：轉(zhuǎn)錄 翻譯廣義：包括 rRNA、tRNA的表達(dá)13二、基因表達(dá)調(diào)控的意義 生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定時(shí)期只有一小部分基因處于活化狀態(tài)，能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（例如，真核細(xì)胞約25基因具轉(zhuǎn)錄活性）。因此，機(jī)體內(nèi)存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)，使生物體適應(yīng)環(huán)境、調(diào)節(jié)代謝、維持其生長(zhǎng)與繁殖?；虮磉_(dá)調(diào)控的意義：14三、基因表達(dá)的規(guī)律* 階段特異性 （時(shí)間特異性） 組織特異性 （空間特異性）15 階段特異性 （時(shí)間特異性）甲胎蛋白 某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按一定的時(shí)間順序發(fā) 生，稱時(shí)間特異性* 多細(xì)胞生物的不同基因在不同發(fā)育階段按特定 時(shí)間順序開(kāi)啟和

5、關(guān)閉，稱階段特異性*哺乳類nAChR： 胚胎型2(煙堿型乙酰膽堿受體) 成年型216 組織特異性 （空間特異性）在個(gè)體生長(zhǎng)的某一階段， 不同細(xì)胞有不同基因表達(dá)胰島素：胰島細(xì)胞血紅蛋白：紅細(xì)胞鳥(niǎo)氨酸循環(huán)酶類：肝細(xì)胞X YX Y AB17四、基因表達(dá)的方式 有些基因的產(chǎn)物對(duì)于生物體的整個(gè)生命過(guò)程都是必不可少的，這類基因在生物體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，這類基因被稱為管家基因。這類基因的表達(dá)稱為基本的基因表達(dá)* 。例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編碼基因基本的基因表達(dá)也是在一定機(jī)制控制下進(jìn)行（一）基本的基因表達(dá)18（二）可調(diào)節(jié)的基因表達(dá) 與管家基因不同，另一些基因表達(dá)狀況極易受外環(huán)境變化的影響，隨外環(huán)

6、境變化，這類基因表達(dá)水平可升高或降低,又稱適應(yīng)性表達(dá)；又稱奢侈基因。 特點(diǎn)：不是細(xì)胞生命必不可少的 表達(dá)受外環(huán)境的影響較大，不恒定表達(dá) 有間斷性和空間特異性 誘導(dǎo) 基因表達(dá)水平在特定環(huán)境中增高的現(xiàn)象 這類基因叫可誘導(dǎo)基因阻遏基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答表現(xiàn)為表達(dá)水平降低這類基因叫可阻遏基因 DNA損傷：DNA損傷修復(fù)酶被誘導(dǎo) 色氨酸供應(yīng)充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏20五.基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控在多級(jí)水平上進(jìn)行基因激活 轉(zhuǎn)錄起始* 轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn) mRNA降解 翻譯及翻譯后加工 蛋白質(zhì)降解21六、基因表達(dá)調(diào)控原理以mRNA轉(zhuǎn)錄為例DNA元件 調(diào)節(jié)蛋白R(shí)NA聚合酶活性*調(diào)控要素（一）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)

7、基因表達(dá) （1） DNA元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列操縱子：由功能上相關(guān)的一組酶或蛋白質(zhì)基因在染色體上串聯(lián)一起并共同享用同一表達(dá)調(diào)控的DNA組件所構(gòu)成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。操縱子調(diào)節(jié)序列編碼序列：編碼蛋白質(zhì)啟動(dòng)序列：結(jié)合RNA聚合酶操縱序列：結(jié)合阻遏蛋白*1、原核生物 操縱子結(jié)構(gòu)編碼序列 啟動(dòng)序列 操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(coding sequence) 原核生物啟動(dòng)序列（啟動(dòng)子）RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16

8、N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列 （2）調(diào)節(jié)蛋白特異因子 決定RNA聚合酶特異識(shí)別并結(jié)合 啟動(dòng)序列的能力（因子）阻遏蛋白 與操縱序列結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性 （負(fù)性調(diào)節(jié)）激活蛋白 促進(jìn)RNA聚合酶活性（正性調(diào)節(jié)） （3） RNA聚合酶活性 DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)作用最終由RNA聚合酶活性體現(xiàn)。 啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)蛋白的性質(zhì)對(duì)RNA聚合酶活性影響最大。 2. 真核生物（1） 順式作用元件：（2） 反式作用因子： （3） mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)28第二節(jié) 原核基因表達(dá)調(diào)控與真核基因

9、表達(dá)調(diào)控的基本原理29一、原核基因表達(dá)及其調(diào)控的特點(diǎn) 1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過(guò)程緊密偶聯(lián) 3、操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制中普遍存在阻遏蛋白介導(dǎo) 的負(fù)性調(diào)節(jié)*2、普遍存在操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制阻遏蛋白操縱序列結(jié)合阻遏解聚結(jié)合去阻遏 阻礙 4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順?lè)醋觤RNA 5、轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)*多順?lè)醋觤RNA：多個(gè)功能相關(guān)的基因串聯(lián)， 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在 一條mRNA上，翻譯產(chǎn)物為多個(gè)多肽鏈31二、操縱子理論通常一個(gè)操縱子含有一個(gè)啟動(dòng)序列及數(shù)個(gè)編碼基因（26個(gè)，甚至更多），還有其它調(diào)節(jié)序列。 編碼序列 啟動(dòng)序列 操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操縱

10、子結(jié)構(gòu)32乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制 阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié) CAP的正性調(diào)節(jié) 協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) 乳糖操縱子結(jié)構(gòu) CAP結(jié)合位點(diǎn)P IIPOZYA調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)基因I: 阻遏蛋白編碼基因PI: 阻遏蛋白基因啟動(dòng)序列Z: -半乳糖苷酶Y: 透酶A: 乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因O:操縱序列（阻遏蛋白結(jié)合部位）P:啟動(dòng)序列CAP結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控區(qū) 1. 阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（無(wú)乳糖） *阻遏蛋白與O序列結(jié)合, 抑制轉(zhuǎn)錄, lac操縱子關(guān)閉阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點(diǎn)P IIPOZYARNA聚合酶 誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，lac操縱子開(kāi)啟乳糖別乳糖CAP結(jié)合位點(diǎn)P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的負(fù)

11、性調(diào)節(jié)（有乳糖） * CAP: 分解代謝基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚體cAMP 結(jié)合區(qū) DNA 結(jié)合區(qū) 2. CAP的正性調(diào)節(jié)（無(wú)葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP結(jié)合位點(diǎn)mRNA無(wú)葡萄糖，cAMP濃度高cAMP與CAP結(jié)合 與CAP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性提高約50倍 CAP的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP結(jié)合位點(diǎn)mRNA有葡萄糖，cAMP濃度低cAMP與CAP結(jié)合受阻轉(zhuǎn)錄活性下降 阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點(diǎn)P IIPOZYARNA聚合酶 3. 阻遏蛋白與CAP的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)*（1）

12、無(wú)乳糖時(shí), 阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄， CAP無(wú)作用 （2） 有乳糖時(shí), 乳糖操縱子去阻遏, 雖可轉(zhuǎn) 錄, 但活性很低, 必須由CAP的正性調(diào)節(jié)來(lái)加強(qiáng)P IIPOZYACAP結(jié)合位點(diǎn)mRNA THANK YOUSUCCESS2022/7/2641可編輯 乳糖操縱子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖43（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 1. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?一個(gè)基因 一條mRNA 一條多肽鏈2. 重復(fù)序列 高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、單拷貝序列3. 基因不連續(xù)性 非編碼序列 內(nèi)含子12353三、真核基因表達(dá)調(diào)控 （二） 真核基因轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)活性染色體結(jié)構(gòu)變化 對(duì)核酸酶敏感、甲基化程度降低、 組蛋白乙酰化修

13、飾2. 正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo) 真核RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力極小或根本沒(méi)有 實(shí)質(zhì)的親和力，轉(zhuǎn)錄起始需依賴多種激活蛋白的作用3轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進(jìn)行 轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在胞漿進(jìn)行45 轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實(shí)質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用 1、順式作用元件：2、反式作用因子： 3、mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié) 1. 順式作用元件* 指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，因其作用于自身分子并發(fā)揮作用，所以稱順式作用元件。 根據(jù)位置、性質(zhì)及作用方式的不同分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制子。47 真核生物 順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列 啟動(dòng)子(promoter)P 抑制子(silencer)

14、增強(qiáng)子(enhancer) 增強(qiáng)子(enhancer)48RNA聚合酶II啟動(dòng)位點(diǎn)周圍一 組轉(zhuǎn)錄控制組件常見(jiàn)組件： TATA盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒 （GGGCGG） CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-30bp -110bp啟動(dòng)子 promoter 增強(qiáng)子* ： 遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、決定組織特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn) 錄活性的特異DNA序列，其發(fā)揮作用的方式與方向、距 離無(wú)關(guān)。 抑制子* ： 對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用的 DNA序列 負(fù)性調(diào)節(jié)元件 2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子） 轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白 基本轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄激活因子 轉(zhuǎn)

15、錄抑制因子 絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達(dá)后，通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用控制另一基因的轉(zhuǎn)錄。 AB RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子 基本轉(zhuǎn)錄因子FEBDARNA pol TATADNATATA TFD TFA TFB TFF TFERNA pol 轉(zhuǎn)錄激活因子 （正性調(diào)節(jié)因子） 通過(guò)DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起 正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。 轉(zhuǎn)錄抑制因子 （負(fù)性調(diào)節(jié)因子） 通過(guò)DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起負(fù) 性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。與增強(qiáng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與抑制子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子55真核RNA聚合酶II不能單獨(dú)識(shí)別啟動(dòng)子，而是由基本

16、轉(zhuǎn)錄因子TFIID識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，形成TFIID啟動(dòng)子復(fù)合物，然后有一系列的轉(zhuǎn)錄因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始復(fù)合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。3mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)56第三節(jié) 重組DNA技術(shù)基因重組（genetic recombination） 自然發(fā)生的基因重排 真核、原核均會(huì)發(fā)生 基因變異、物種演變、生物進(jìn)化的基礎(chǔ)基因工程（genetic engineering）重組DNA技術(shù)人工進(jìn)行基因重組58 克隆*(名詞)：就是指來(lái)自同一母本的所有副本或 拷貝的集合。 克隆化（動(dòng)詞）：獲取同一拷貝的過(guò)程。二、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念母本克隆cloneclonin

17、g（一） 克隆與克隆化 細(xì)胞克?。?從大量群體細(xì)胞中分離出某一種類型細(xì)胞， 經(jīng)擴(kuò)增獲得這樣一類相同的細(xì)胞。在分子生物學(xué)領(lǐng)域所說(shuō)的分子克隆專指 DNA克隆(DNA cloning)。 分子克隆： 從眾多不同的分子群體中分離到的很多相同分子的集合。60（二）重組DNA技術(shù)* 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（目的基因或目的DNA）與載體DNA連接成復(fù)制子，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增、提取，獲得大量目的DNA的無(wú)性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。 目的 DNA 載體DNA連接復(fù)制子（重組DNA）導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)

18、化子細(xì)胞轉(zhuǎn)化子細(xì)胞擴(kuò)增，可獲得大量重組DNA 基因克隆DNA 克隆重組DNA同一概念生物技術(shù)工程基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程 獲得DNA的無(wú)性繁殖系 獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物重組DNA的目的 63（三） 工具酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶 限制性核酸內(nèi)切酶*識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序列的一類核酸酶。限制性核酸內(nèi)切酶共分三類，基因工程常用II類酶，這類酶常識(shí)別DNA的回文序列 * 。 Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CAA TTG -5平端Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -53突出粘性末端EcoR

19、I：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -55突出粘性末端 （四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在體外以RNA（通常為mRNA）為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA?；蚪MDNA(genomic DNA) 代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。目的基因又稱外源DNA67 攜帶外源DNA，實(shí)現(xiàn)外源DNA無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 常用載體： 質(zhì)粒 噬菌體DNA 病毒DNA質(zhì)粒 （1）雙鏈環(huán)狀DNA，細(xì)菌染色體外 （2）2 - 3kb 或 數(shù)百kb （3）獨(dú)立自主復(fù)制，穩(wěn)定遺傳 （4）遺傳標(biāo)志

20、 (五) 基因載體 （克隆載體）68三、重組DNA技術(shù)的原理 與基本過(guò)程*1. 獲取目的基因2. 選擇、構(gòu)建基因載體3. 目的基因與載體連接，形成重組分子4. 重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5. 篩選、擴(kuò)增6. 表達(dá)目的基因 +載體目的基因重組DNA分子細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴(kuò)增篩選70（1） 化學(xué)合成 （4） PCR（2） 基因組DNA文庫(kù) （3） cDNA文庫(kù) 1. 獲取目的基因 組織或細(xì)胞染色體 限制性內(nèi)切酶多個(gè)DNA片段載體多種轉(zhuǎn)化子 （基因文庫(kù)）重組DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA文庫(kù)72聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 在有特定模板、特異DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在時(shí)，向DNA合成體系內(nèi)加入耐熱的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶* ），經(jīng)反復(fù)變性、退火及延伸的多個(gè)循環(huán)反應(yīng)，生成特異DNA產(chǎn)物的過(guò)程。 變性：解開(kāi)模板雙鏈DNA 95 退火：使引物與單鏈模板DNA結(jié)合 55 延伸：DNA鏈的合成 72 2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建 目的基因不能自我復(fù)制 3. 目的基因與載體連接（DNA連接酶* ）重組DNA4. 重組DNA導(dǎo)入受體菌安全菌 感受態(tài)導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 感染 5. 重