限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各種限制性酶能識(shí)別特定的堿基序列， 并將其切開(kāi)。堿基的變異 可能導(dǎo)致切點(diǎn)的消失或新切點(diǎn)的出現(xiàn)，從而引起 DNA片段長(zhǎng)度和數(shù) 量的差異。用特定的限制性內(nèi)切酶消化目標(biāo) DNA并通過(guò)電泳將長(zhǎng)度 不同的片斷分開(kāi)，并印記于硝酸纖維濾膜上，再與相應(yīng)的探針雜交， 就可以檢測(cè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP).二主要材料DNA抽提用試劑，限制性內(nèi)切酶，dNTP及Taq聚合酶電泳用瓊 脂糖或聚丙烯酰胺配制試劑，PCR擴(kuò)增儀，水浴鍋，電泳儀和電泳梢， 硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，探針標(biāo)記物等

2、。三方法步驟(圖1)四幫口aDNAHtt內(nèi)口0愛(ài)賽電泳醒DMA片感K跳慳片tr般射性保圮的與 茶國(guó)x jlMB RNA或DZA片J門(mén)，確咬好 射佐賽(2mMttDNA 片總1破立好綣震（一）樣本DNA制備采用常規(guī)DNA抽提的方法或DNA抽提試劑盒提取樣本DNA, 置低溫下保存。對(duì)大多數(shù)樣本而言，用于分析的樣本 DNA片段須先 從總DNA中分離獲取，并制備足夠的量。為此， RFLP分析常先用 PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)片段。無(wú)論怎么做，必須保證 DNA樣本的純度， 這一點(diǎn)是非常重要的。（二）限制性內(nèi)切酶降解樣本 DNA根據(jù)不同的目標(biāo) DAN ,選擇合適的限制性內(nèi)切酶。目前常用的 限制性內(nèi)切酶有EcoRI

3、和Hind in等。該步驟必須保證酶解完全。如 果有必要，可以用瓊脂糖凝膠電泳澳化乙錠分析酶解結(jié)果。酶解的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定。（三）電泳電泳的主要目的是把 DNA片段按大?。ㄩL(zhǎng)短）分離開(kāi)來(lái)，得到一 個(gè)根據(jù)分子量排列的連續(xù)帶譜。電泳可采用瓊脂糖凝膠電泳，也可采 用聚丙烯酰胺凝膠電泳。時(shí)間由幾小時(shí)到 24小時(shí)不等。（四）轉(zhuǎn)印所謂轉(zhuǎn)印，就是將已經(jīng)電泳的 DNA片段通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)到固 相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纖維素濾膜或尼龍膜。轉(zhuǎn)印前需經(jīng)過(guò)堿變性溶液處理，將雙鏈DNA變性為單鏈DNA。轉(zhuǎn)印的方法 一般有三種。根據(jù)DNA分子的復(fù)雜度轉(zhuǎn)移212小時(shí)。1鹽橋法；也叫毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法。先把硝酸纖維素

4、濾膜放在20X SSC 溶液中浸透，然后把濾膜平鋪在凝膠上，再在濾膜上放上浸過(guò)20XSSC溶液的濾紙3張，再在該濾紙層上鋪上干燥的濾紙 3張，由于濾 紙的吸附作用，膠下的緩沖液透過(guò)凝膠被吸附上來(lái)，同時(shí)膠中的DNA 分子就轉(zhuǎn)移到濾膜上。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單， 不需要用其他儀器。缺 點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。2電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后，可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該 法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫喋吟/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。 缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真 空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí)，才采用電泳轉(zhuǎn)移。3真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器，它們一般是將硝酸纖維 素膜

5、或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖 液從上面的一個(gè)貯液梢中流下，洗脫出凝膠中的 DNA,使其沉積在濾 膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度（4-5mm）和正 常瓊脂糖濃度（1%）的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來(lái)。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信 號(hào)比鹽橋法轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂，并且在 洗膜不嚴(yán)格時(shí)，其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。（五）烤膜去除紙巾等，用藍(lán)色圓珠筆在濾膜右上角記下轉(zhuǎn)移日期，做好記號(hào), 取出濾膜，在2XSSC中洗5分鐘，涼干后在80c中烘烤2小時(shí)。注意在 使用尼龍膜雜交時(shí)，只能空氣干燥，不得烘烤。（六）預(yù)雜交將濾膜放入含預(yù)雜交液的密封小塑料袋中，將預(yù)雜

6、交液加在袋的底部，前后擠壓小袋，使濾膜濕透。在一定溫度下（一般為37-42C）預(yù) 雜交3-12小時(shí)，棄去預(yù)雜交液。預(yù)雜交液中并不含有探針，該步的 主要目的是減低背景，為雜交作準(zhǔn)備。（七）探針的制備探針是一種已知特異性的分子，它的制備首先需要獲得所要的特 異性的DNA片段。然后再用放射性物質(zhì)標(biāo)記，如P32, a-PdNTPd等。 用這些物質(zhì)標(biāo)記雖然靈敏性高，效果好，但不安全。另外，在試驗(yàn)中 還常用地高辛標(biāo)記，它沒(méi)有半衰期且安全性好。標(biāo)記的方法常用缺口 平移法、末端標(biāo)記法、隨機(jī)引物延伸法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。該步驟必須 保證探針的純度以防止在雜交過(guò)程中出現(xiàn)雜帶。并且探針在雜交前也要使之變性。（八）雜交在

7、雜交液中加入探針，混勻。如步驟（六）將混合液注入密封塑 料袋中，在與預(yù)雜交相同溫度下雜交6-12小時(shí)。（九）洗膜漂洗去非特異性結(jié)合的探針。（十）放射自顯影和分析空氣干燥硝酸纖維素濾膜，然后在X光片上曝光。通常曝光1-2 天后可見(jiàn)DNA譜帶。然后對(duì)譜帶進(jìn)行分析。四 RFLP的主要應(yīng)用（一）遺傳圖譜和物理圖譜的繪制。所用的探針來(lái)源于同種或不同種基因組 DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記（mark）,構(gòu)建分子圖譜。當(dāng) 某個(gè)性狀（基因）與某個(gè)（些）分子協(xié)同分離時(shí)，表明這個(gè)性狀（基因）與分 子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小， 即表示目標(biāo)基因與 分子標(biāo)記的距離，從而可將

8、基因定位在分子圖譜上。（二）系統(tǒng)發(fā)育分析將不同物種的DNA分子進(jìn)行雜交，可以通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái) 確定物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。比如，在狐蝠亞科中，主要有兩種食 性的蝙蝠，即食花蜜狐蝠和食果實(shí)狐蝠，通過(guò)對(duì)這兩種食性的物種進(jìn) 行RFLP分析和比較，構(gòu)建兩個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，就可以確定食果 實(shí)狐蝠是由食花蜜狐蝠進(jìn)化而來(lái)。（三）基因診斷以及疾病基因的檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上，如果要檢驗(yàn)病人的某基因是否發(fā)生癌變， 可以先制備 該基因在正常情況下的 cDNA ,然后把它與病人的這個(gè)基因進(jìn)行雜 交，即通過(guò)RFLP分析，就可以確定該基因是否發(fā)生癌變。（四）親子鑒定和痕跡檢驗(yàn)在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，能準(zhǔn)確進(jìn)行親子鑒定的是 DNA檢測(cè)

9、，檢測(cè)方法 并非檢測(cè)出全部堿基順序，而是進(jìn)行 DNA雜交，即把所要檢測(cè)的兩 人的衛(wèi)星DNA進(jìn)行雜交，再比較差異大小，從而說(shuō)明兩人的血緣關(guān) 系，如父子、母女等。另外，在公安機(jī)關(guān)的刑事偵察中，也常用DNA 雜交技術(shù)進(jìn)行痕跡檢驗(yàn)。犯罪分子只要留下一絲一毫的身體細(xì)胞遺留 物，如血液、皮屑、毛發(fā)等，技術(shù)人員就可以把犯罪嫌疑人的DNA樣本和現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的遺留物中提取的 DNA樣本通過(guò)DNA雜交，比較 它們是否相同，從而確定現(xiàn)場(chǎng)留下的痕跡是否為犯罪嫌疑人的。五對(duì)RFLP的評(píng)價(jià)與其他的很多分子生物學(xué)技術(shù)相比， RFLP技術(shù)是比較完善和相 對(duì)經(jīng)典的。例如，在植物中它可以用來(lái)測(cè)定多態(tài)性是由父本還是母本 產(chǎn)生的。另外，相對(duì) RAP球說(shuō)，它可用來(lái)測(cè)定由多態(tài)性產(chǎn)生的突變 類型究竟是由堿基突變或倒位還是由缺失、插入造成的。然而，雖然 RFLP有很多優(yōu)點(diǎn)，但它也具有很多缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。 （一）操作比較煩瑣