科技探索之路　基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程 (3)

1、基因工程基因工程： 又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀?；蚬こ蹋?又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。一、DNA重組技術(shù)的基本工具準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”） 限制酶DNA片段的連接工具（“分子縫合針”） DNA連接酶基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車”） 運(yùn)載體1、限制酶 識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。E

2、coR黏性末端黏性末端中心軸線兩側(cè)切開限制酶切割的是什么？?jī)蓚€(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵.磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲?。?）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因： 主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取方法： （1）從基因文庫中獲取目的基因； （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因； （3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？ 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，每個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同

3、基因，稱為基因文庫?；蛭膸?基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大某種生物的部分基因某種生物的全部基因真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子內(nèi)含子： 外顯子： 基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目

4、的基因PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_b

5、、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈 過程：高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步曲PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成（三）人工合成法-不需要模板二、基因表達(dá)載體的

6、構(gòu)建 目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?；蚬こ痰暮诵腶、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)表達(dá)載體啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來 用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出_。 用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，

7、形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶過程:注意：載體與表達(dá)載體的區(qū)別二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)使用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使其露出相同的黏性末端，再加入DNA連接酶。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化 目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2+處理法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單

8、子葉植物沒有感染能力。 原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上?；驑尫ǎ耗康幕?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 轉(zhuǎn)基因受精卵 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合用Ca2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞

9、都能攝 入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？ 不一定，需要檢測(cè) 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因大腸桿菌1、鑒定分子水平的鑒定（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因方法DNA分子雜交技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)1、鑒定分子水平的鑒定方法分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA1、鑒定分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶脫分

10、化組織培養(yǎng)2、鑒定個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。（一）植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用1、提高農(nóng)作物的抗逆能力 （1）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 三、基因工程的應(yīng)用（2）抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物所用的基因：常用：病毒外殼蛋白基因和病毒的復(fù)制酶基因抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中有：幾丁質(zhì)酶基因和抗毒素合成基因（3）其它抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗鹽堿、干旱的基因：調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的基因抗凍蛋白基因抗除草劑基因2、改良農(nóng)作物的品質(zhì)富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米導(dǎo)入與植物花青素代謝有關(guān)的基因的矮牽牛3

11、、利用植物生產(chǎn)藥物二、動(dòng)物基因工程前景廣闊（一）用于提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度動(dòng)物品種改良、建立生物反應(yīng)器、器官移植等導(dǎo)入外源生長(zhǎng)激素基因（二）用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)舉例說明將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大減低。（三）用轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物生產(chǎn)藥物設(shè)問:就基因藥物而言，最理想的表達(dá)場(chǎng)所是哪里？將藥物蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子等調(diào)控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中，將受精卵送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。乳腺生物反應(yīng)器獲取目的基因（例如血清白蛋白基因）構(gòu)建基因表

12、達(dá)載體（在血清白蛋白基因前加特異表達(dá)的啟動(dòng)子）顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中形成胚胎將胚胎移植入母體動(dòng)物子宮發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（只有在產(chǎn)下的雌性個(gè)體的乳腺細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入的基因才能特異表達(dá)）。思考:用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的操作過程是怎樣的？ 膀胱生物反應(yīng)器目的基因在膀胱上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)（四）用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體利用基因工程對(duì)豬的器官進(jìn)行改造方法：將器官供體基因組導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達(dá)或設(shè)法除去抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官三、基因工程藥品異軍突起工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表達(dá)的菌類細(xì)胞株系。四、基因

13、治療曙光初照 把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，是治療遺傳病的最有效的手段。（把特定的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的）體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)基因治療：直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的治病方法。（如將治療囊性纖維病的正?；蜣D(zhuǎn)入患者肺組織）DNA分子雜交是基因診斷最基本的方法之一。當(dāng)用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與被測(cè)基因進(jìn)行接觸，若兩者的堿基完全配對(duì)成雙鏈，則表明被測(cè)基因中含有已知的基因序列?；蛟\斷五、基因芯片 從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜；從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。 通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。 基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。-DNA探針陣列蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)氨基酸序列多肽鏈基因DNA預(yù)期功能DNA合成分子設(shè)計(jì)mRNA生物功能轉(zhuǎn)錄翻譯折疊蛋白質(zhì)工程流程圖蛋白質(zhì)工程目標(biāo)： 根據(jù)人們對(duì)蛋白質(zhì)功能的特定需求，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通