第5章熒光分析法

1、第四章 熒光分析法第四章 熒光分析法 某些物質(zhì)吸收一定的光能后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為光致發(fā)光，包括熒光和磷光。在熒光基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法稱(chēng)為熒光分析法。 基態(tài)時(shí)，軌道中的兩個(gè)電子，自旋方向相反，總自旋量子數(shù)S=1/2+（-1/2）=0。此時(shí)電子能態(tài)的多重性M=2S+1=1, 稱(chēng)為基態(tài)單重態(tài)，用符號(hào)So表示 。（一） 分子的多重態(tài)一、分子的激發(fā)與去激發(fā)第一節(jié) 基本原理T1S0S0S1 基態(tài)單重態(tài)的分子吸收光能后，自旋配對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高的電子能級(jí)。如果躍遷過(guò)程中，電子的自旋方向不變，這種狀態(tài)稱(chēng)為激發(fā)單重態(tài)，以S1、S2 表示。S0S

2、0S1T1 如果躍遷過(guò)程中，電子的自旋方向發(fā)生改變，這種狀態(tài)稱(chēng)為激發(fā)三重態(tài)，以T1、T2表示。 激發(fā)單重態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而激發(fā)三重態(tài)的平均壽命為10-4 10s。S0S0S1T0T1S=1/2+1/2=1, M=2S+1=3,S0雙重態(tài)只有在含有單個(gè)電子的分子或原子中出現(xiàn)D（二）激發(fā)態(tài)分子的去激發(fā) 處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式再回到基態(tài)。 1.輻射躍遷：產(chǎn)生熒光或磷光。（1）發(fā)射熒光 電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)SO各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光輻射叫做熒光。無(wú)論開(kāi)始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過(guò)無(wú)輻射躍遷到S1的最低振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射熒光，所以熒光

3、波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。 熒光發(fā)射的持續(xù)時(shí)間為108S左右，故外部激發(fā)光源停止照射后，熒光馬上熄滅。熒光第二電子激發(fā)的單線(xiàn)態(tài)振動(dòng)弛豫電子躍遷內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換發(fā)射熒光體系間跨越發(fā)射磷光熒光光譜法原理內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換，熒光消失S0S1S2T1T2l 1l 2l 3l 2吸收(2).發(fā)射磷光 當(dāng)受激電子降到S1的最低振動(dòng)能級(jí)后，未發(fā)射熒光，而是經(jīng)過(guò)體系間跨越到T1振動(dòng)能級(jí)，再經(jīng)振動(dòng)馳豫到 T1最低振動(dòng)能級(jí)，從T1最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所發(fā)射的光叫磷光。磷光的波長(zhǎng)比熒光還要長(zhǎng)。 磷光發(fā)射的持續(xù)時(shí)間為104 10S左右，故外部激發(fā)光源停止照射后，磷光還會(huì)持續(xù)一段時(shí)間。 在室溫下能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)

4、很少，故磷光分析法的應(yīng)用不如熒光分析法廣泛。磷光（1）振動(dòng)馳豫（Vibrational Relaxation, VR） 在同一電子能級(jí)中，分子經(jīng)過(guò)振動(dòng)由較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)，以熱 的形式釋放所吸收的能量。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為1012S數(shù)量級(jí)。 2.無(wú)輻射躍遷：振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)部轉(zhuǎn)化（ic）、系間跨越（isc）、外部轉(zhuǎn)換等。(2) 內(nèi)部轉(zhuǎn)換（Internal Conversion，IC） 處于各高激發(fā)單重態(tài)的電子，都可以通過(guò)一系列內(nèi)轉(zhuǎn)移及振動(dòng)弛豫，回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。 對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊

5、的能層之間通過(guò)振動(dòng)耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。(3) 系間跨越（Intersystem Conversion，ISC）(4)外部轉(zhuǎn)換（碰撞熄滅） 指溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子之間相互碰撞，以熱能的形式釋放能量的過(guò)程。外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。 當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過(guò)自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，該過(guò)程稱(chēng)為系間跨躍。二. 熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜： 熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜 1.

6、熒光激發(fā)光譜: 固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)em，連續(xù)變化激發(fā)波長(zhǎng)ex ，以熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)，激發(fā)光波長(zhǎng)為橫座標(biāo)繪制的圖譜。該圖譜反映了所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)的依賴(lài)關(guān)系。發(fā)射波長(zhǎng)：Emission wavelength； 激發(fā)波長(zhǎng)：Excitation wavelengthFex作用：用于激發(fā)波長(zhǎng)的選擇 2.熒光發(fā)射光譜: 固定激發(fā)波長(zhǎng)ex，連續(xù)變化發(fā)射波長(zhǎng)em,測(cè)定不同發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，以其熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，繪制的圖譜。 該圖譜反映了在某固定激發(fā)波長(zhǎng)下，熒光發(fā)射波長(zhǎng)的分布范圍。I熒光強(qiáng)度exem硫酸奎寧的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜作用：定性（某物質(zhì)的發(fā)射光譜

7、只有一個(gè)）定量時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)的選擇Fem 熒光發(fā)射波長(zhǎng)em大于熒光激發(fā)波長(zhǎng)ex的現(xiàn)象，產(chǎn)生的主要原因是激發(fā)態(tài)分子發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) （1） Stokes位移 3.熒光發(fā)射光譜的特點(diǎn)不論用哪一個(gè)波長(zhǎng)的光輻射激發(fā)，電子都從第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層，所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（3 ）熒光發(fā)射光譜和熒光激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系 熒光發(fā)射光譜是激發(fā)分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層回到基態(tài)中各不同能層形成的。所以熒光發(fā)射光譜的形狀決定于基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布。 基態(tài)中振動(dòng)能級(jí)的分布和第一電子激發(fā)態(tài)中

8、振動(dòng)能級(jí)的分布情況是類(lèi)似的。 因此熒光發(fā)射光譜的形狀和熒光激發(fā)光譜的形狀極為相似。激發(fā)光譜：S0(V=0)S1*(V=1,2,3,4)熒光光譜：S1*(V=0)S0(V=1,2,3,4) 蒽的能級(jí)躍遷分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：1.分子必須具有 * 或n * ，且能吸收紫外 或可見(jiàn)光的共軛結(jié)構(gòu)。2.熒光效率（熒光量子產(chǎn)率）三、 熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（一）熒光效率 熒光效率也叫熒光量子產(chǎn)率，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示 （二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系在其他條件一定時(shí)，熒光效率越高，熒光強(qiáng)度就越大。1.具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)；2.具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；3.取代基團(tuán)為給電子取代基。1. 共軛結(jié)構(gòu)

9、 芳香族化合物因具有較大的共軛結(jié)構(gòu)，多數(shù)能產(chǎn)生熒光。 產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於?省戊 省exmax(nm)205286365390580emmax (nm)278321400480640F0.10.290.460.600.52ex=327nm， em=510nm 含有長(zhǎng)共軛雙鍵的脂肪烴也可能有熒光，但這類(lèi)化合物的數(shù)目不多。2. 剛性平面結(jié)構(gòu) 剛性平面結(jié)構(gòu)可使電子的共軛程度增大。這種結(jié)構(gòu)還可以減少分子的振動(dòng)，減少了無(wú)輻射去激發(fā)的可能性。原因是芴上的亞甲基增強(qiáng)了分子的剛性。二苯乙烯順式?jīng)]有熒光，反式有強(qiáng)烈熒

10、光。？芴聯(lián)苯F=1.0F=0.2不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92萘VAF(萘)= 5F(VA) 熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯 有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光較弱，但和金屬離子形成配合物后，如果剛性和共平面性增加，就可以發(fā)熒光或增強(qiáng)熒光。如8-羥基喹啉是與Mg2+、Al3+ 等金屬離子形成的配合物的熒光增強(qiáng)，利用這一特點(diǎn)可以間接測(cè)定金屬離子。 弱熒光物質(zhì)強(qiáng)熒光物質(zhì)，3.取代基效應(yīng)給電子基團(tuán) -OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等，由于p共軛，增加了電子的共軛程度，使熒光強(qiáng)度增大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。吸電子基團(tuán)-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH、-F、-Cl、-Br

11、、-I等, 由于吸電子效應(yīng)，減小了電子的共軛程度，使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅。 化合物 苯胺 苯酚 苯 氯苯 苯甲酸熒光相對(duì)強(qiáng)度 20 18 10 7 3（三）影響熒光強(qiáng)度的因素1.溫度 隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，非輻射躍遷顯著增大。所以，大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。2.溶劑 溶劑極性的影響：增大溶劑的極性，使躍遷的能量減小，躍遷幾率增加，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增大，熒光峰紅移。 溶劑粘度的影響：粘度降低則分子碰撞機(jī)會(huì)增加，使無(wú)輻射躍遷增加，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱。3.酸度 當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸弱堿時(shí)，酸度影響離解平衡，從而對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生較大

12、影響。例如苯酚：pH1有熒光pH13無(wú)熒光對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑生成的熒光配合物，溶液pH值的改變會(huì)影響配合物的組成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。例如Ga3+離子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能產(chǎn)生熒光。而在pH67的溶液中，則形成12的配合物，不產(chǎn)生熒光。 4.熒光熄滅劑 能使熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅的物質(zhì)稱(chēng)為熒光熄滅劑。常見(jiàn)的熄滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羰基化合物等。 熒光熄滅的原因：熄滅劑氧化熒光物質(zhì)或與熒光物質(zhì)生成配合物；熄滅劑與熒光物質(zhì)發(fā)生某種作用，使非輻射躍遷幾率增大。 在熒光分析法中，熄滅劑的存在，如果熒光強(qiáng)度的減小和熒光熄滅劑

13、的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，則可利用這一性質(zhì)，測(cè)定熄滅劑的含量。這種方法稱(chēng)為熒光熄滅法。5.散射光的影響種類(lèi)瑞利光(Reyleigh scattering light)：彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，波長(zhǎng)及頻率不變。拉曼光(Raman scattering light)：非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子的運(yùn)動(dòng)方向和波長(zhǎng)、頻率均發(fā)生改變。較長(zhǎng)拉曼光干擾熒光測(cè)定。散射光(scattering light)：由于光子與物質(zhì)分子相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。 散射光主要是由大量的溶劑分子所產(chǎn)生的。拉曼峰熒光峰通過(guò)選擇合適的測(cè)定波長(zhǎng)和狹縫寬度減小散射光的干擾選擇激發(fā)波長(zhǎng)max?

14、emmax第二節(jié) 定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系當(dāng)A=ECL0.05時(shí)，展開(kāi)式中第三項(xiàng)及以后各項(xiàng)可以忽略。當(dāng)A=ECL0.05時(shí)，即低濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度呈線(xiàn)性關(guān)系；當(dāng)A=ECL0.05時(shí)，即高濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度不呈線(xiàn)性關(guān)系。增大激發(fā)光強(qiáng)度I0，改進(jìn)檢測(cè)和放大系統(tǒng)，可有效提高檢測(cè)的靈敏度。二、定量分析方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成一系列標(biāo)液。測(cè)定標(biāo)液的熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對(duì)標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)試液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。 由于熒光的絕對(duì)強(qiáng)度受許多因素的影響，實(shí)際測(cè)量的都是相對(duì)熒光強(qiáng)度。即以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中某一溶液為基準(zhǔn)或以硫酸喹啉溶液為基準(zhǔn)。2. 比較法 如果標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn)，也可用比較法進(jìn)行測(cè)定。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，配制一個(gè)和試液濃度CX相近的標(biāo)液CS，在相同的條件下測(cè)量它們的熒光強(qiáng)度FX和FS，若空白溶液有熒光F0，必須扣除。然后按下式計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的濃度。第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)1）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2）樣品池：石英（低熒光材料）；3）兩個(gè)單色器：選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；4）檢測(cè)器：光電倍增管。光源第一單色