02實(shí)驗(yàn)二產(chǎn)中性蛋白酶芽孢桿菌的誘變育種

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一株產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的選育山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)系2013.09實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的初步篩選二、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的誘變育種三、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的發(fā)酵復(fù)篩四、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的分類鑒定五、產(chǎn)酶菌株生長曲線的測定六、產(chǎn)酶菌株的菌種保藏實(shí)驗(yàn)二 產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的誘變育種一、目的意義二、材料方法三、數(shù)據(jù)結(jié)果四、討論分析五、參考文獻(xiàn)一、目的意義1、通過菌種選育，篩選獲得一株高產(chǎn)中性蛋白酶的突變菌株。關(guān)鍵技術(shù):實(shí)驗(yàn)原理：紫外線誘變技術(shù)路線：二、材料方法 紫外線的波長在200380 nm 之間，但對誘變最有效的波長僅僅是在253265 nm，一般紫

2、外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254 nm。紫外線誘變育種的原理紫外線誘變的主要生物學(xué)效應(yīng)是由于DNA 變化而造成的，DNA 對紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。紫外線引起DNA 結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA 鏈的斷裂、堿基破壞。但其最主要的作用是使同鏈DNA 的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。經(jīng)紫外線損傷的DNA，能被可見光復(fù)活，因此，經(jīng)誘變處理后的微生物菌種要避免長波紫外線和可見光的照射，故經(jīng)紫外線照射后樣品需用黑紙或黑布包裹。另外，照射處理后的孢子懸液不要貯放太久，以免突變在黑暗中修復(fù)。誘變育種中的幾個(gè)原則

3、 指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。2個(gè)主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機(jī)）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。（一） 出發(fā)菌株（original strain）出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。 具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、 標(biāo)記明顯等）； 對誘變劑敏感野生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：出發(fā)菌株的來源：（二） 菌懸液的制備1

4、. 選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：使每個(gè)細(xì)胞能均勻接觸誘變劑； 減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）2. 同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）3. 菌齡：對誘變劑最敏感時(shí)期 營養(yǎng)細(xì)胞：對數(shù)期 孢子或芽孢：萌發(fā)前期4.菌懸液的制備方法 物理誘變：生理鹽水配制 化學(xué)誘變：緩沖液配制5. 菌懸液的濃度 酵母菌，霉菌的孢子：106個(gè)/mL 細(xì)菌，放線菌孢子：108個(gè)/mL （三）誘變劑的選擇及處理方法1. 誘變劑的選擇（高效，簡便） 物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡便； 化學(xué)誘變劑：頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。 ( NTG超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑2. 劑量的選

5、擇 突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量, 反而會(huì)使突變率下降。 正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。 在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對殺菌率為7075%, 甚至3070%的劑量。 UV的劑量: 固定UV功率和照射距離,以照射時(shí)間長短來確定劑量多少。最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度， 又能使變異向正突變范圍移動(dòng)的劑量。常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）3. 誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理：同一誘變劑的重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.（四） 中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲表型延遲（

6、phenotypic lag）：表型的改變落后于基因型改變的 現(xiàn)象. 分離性延遲： 突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純 合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。 生理性延遲： 由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能 表現(xiàn)出來。生理性延遲:分離性延遲的原因: 對數(shù)生長期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對數(shù)期的細(xì)胞時(shí)，突變通常發(fā)生在一個(gè)核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因: 當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí),由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變

7、異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。（五）突變株的篩選 初篩 復(fù)篩1. 初篩（以量為主）（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）2. 復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測定）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測所需產(chǎn)物方法需簡便、快速2步誘變育種的基本原則： 選擇簡便有效的誘變劑； 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株； 處理單細(xì)胞或單孢子懸液； 選用最適的誘變劑量； 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)

8、； 利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)； 設(shè)計(jì)高效篩選方案； 創(chuàng)造新型篩選方法。 出發(fā)菌株（純化） 前培養(yǎng)（ 培養(yǎng)至對數(shù)期） 菌懸液制備 活菌計(jì)數(shù) 誘變預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劑量存活率曲線） 誘變處理（相對殺菌率為70-75%，30-70%） 活菌計(jì)數(shù) 中間培養(yǎng)（培養(yǎng)過夜，克服表型延遲） 突變株分離初篩復(fù)篩 生產(chǎn)性能試驗(yàn) 菌種（鑒定與）保藏技術(shù)路線：第一次實(shí)驗(yàn)：討論并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案；實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：培養(yǎng)基、無菌水、離心管等；活化：LB培養(yǎng)基，37搖床振蕩16-20hLB發(fā)酵液體培養(yǎng)基蛋白胨：10.0g；酵母膏： 5.0 g；氯化鈉：10.0g；蒸餾水：1000mlpH到 7.0。第二次實(shí)驗(yàn)：（一）菌劑準(zhǔn)備

9、： 離心收集（8000rpm，5min）活化好的菌種；傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。用無菌生理鹽水懸浮菌液，配制成約1.0 108/ml第二次實(shí)驗(yàn)：（二）誘變處理：預(yù)熱：在正式照射前，應(yīng)先開紫外線30min，讓紫外燈預(yù)熱。攪拌：取5ml制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。照射：打開皿蓋邊攪拌邊照射，所有操作必須在黑暗或紅燈下進(jìn)行。第二次實(shí)驗(yàn)：（三）培養(yǎng)：稀釋：在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各1 ml進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離。涂布：取適宜稀釋度的稀釋液0.1ml涂于酪蛋白平板上。培養(yǎng)： 37培養(yǎng)48h， (用黑布包好平板)。注意在每個(gè)平板背后要標(biāo)明處理時(shí)間、稀釋度、組別等。第三次實(shí)驗(yàn)：統(tǒng)計(jì)：菌落計(jì)數(shù)并測量透明圈大小，從中挑選出目標(biāo)菌株。轉(zhuǎn)接：挑取生長飽滿的單菌落轉(zhuǎn)接入LB試管斜面，每個(gè)分離物轉(zhuǎn)接5支試管。保藏：37培養(yǎng)24h，保藏備用；討論下一步實(shí)驗(yàn)方案（發(fā)酵法復(fù)篩）并準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料；三、數(shù)據(jù)結(jié)果處理 10秒 20秒 30秒 對照 稀釋倍數(shù) 菌落數(shù) 存活率/% 致死率/% 四、討論分析致死率誘變率評價(jià)體系五、參考文獻(xiàn)（舉例）1 李紅亞等，