結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證及快速診斷進(jìn)展-Bacteria

1、結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證及快速診斷進(jìn)展國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室1內(nèi)容結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用為什么要進(jìn)行EQAEQA 培訓(xùn)的重要意義4. 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論5. 痰涂片鏡檢的操作原理6. 全球結(jié)核病快速診斷進(jìn)展2結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作在結(jié)核病控制中的作用診斷 （發(fā)現(xiàn)傳染源）治療 （確定治療方案）療效評價(jià)結(jié)核病控制策略和措施的評估3Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tubercle Bacilli10102103104105106Poor microscopy (25%)Good microscopy (55%)Culture

2、 / PCR (25%)X-ray/clinical only (20%) AFB per ml of sputumSlide Courtesy: Van Deun A, Nov 20034細(xì)菌 讓人們聯(lián)想到什么?疾病傳染性流行性食物腐敗在目前已知的細(xì)菌中有1%的細(xì)菌可以導(dǎo)致人患病在目前已知的細(xì)菌中有4%的細(xì)菌可以導(dǎo)致植物得病 95%已知細(xì)菌不具有致病性5為什么要進(jìn)行EQA增加人員的責(zé)任心推行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作確保實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量的提高生物安全的需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)、采集信息6痰涂片鏡檢EQA 培訓(xùn)的意義強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣提高實(shí)驗(yàn)室服務(wù)質(zhì)量提高對結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作的重視逐步提高結(jié)核病防

3、治人員特別是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作人員的地位7結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的流行病學(xué)理論結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價(jià)81. 細(xì)胞2. 通過從環(huán)境中攝取化合物和能量維持其結(jié)構(gòu)3. 對外部刺激的反應(yīng)性4. 復(fù)制、繁衍并傳遞給其子代遺傳信息5. 進(jìn)化適應(yīng)環(huán)境生命的5 個基本特征9結(jié)核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染 95%后期表現(xiàn) - 5%病變早期進(jìn)展 - 5%例如： HIV, 嬰幼兒例如：移民10結(jié)核分枝桿菌的生活周期感染人體內(nèi)生存由肺中排入空氣中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)侵犯人體免疫防御系統(tǒng)免疫激活和營養(yǎng)限制免疫病理釋放調(diào)控因子, 例如 sigma factors釋放抗原性蛋白改變營養(yǎng)需要改變細(xì)胞壁1

4、1微生物和人類Very few microbes arealways pathogenicMany microbes arepotentially pathogenicMost microbes arenever pathogenic12potential pathogen isolated from or detected in clinical samples Recognised syndromes patients clinical condition e.g. septicaemia, endocarditis,osteomyelitis meningitis,UTI, pneumo

5、niapharyngitis我們?nèi)绾沃捞囟ǖ牟≡⑸镏虏?診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實(shí)驗(yàn)室和病人臨床癥狀的聯(lián)系13如何推測特定病原體可以致病?Kochs 推測病原體必須在每一例病例中都出現(xiàn)病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當(dāng)特定的病原體接種到健康機(jī)體時(shí)特定的疾病會發(fā)生病原微生物可以在實(shí)驗(yàn)動物中恢復(fù)14Spectrum of virulencepoliomyelitis in a child0.1-1% of infections are clinically apparentrubella50% of infections are clinically

6、 apparentrabies100% of infections are clinically apparent傳染性疾病的冰山理論asymptomatic infectionclassical clinical diseaseless severe disease15水庫理論發(fā)病人數(shù)死亡人數(shù)治愈人數(shù)現(xiàn)有病人數(shù)16痰涂片鏡檢的操作原理17分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史1590 年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀(jì)末,顯微鏡技術(shù)、染色技術(shù)已應(yīng)用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)條件已成熟在發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌前,科霍已是一位在微生物學(xué)方面取得豐碩成果的學(xué)者.18Robert Koch 第一個證明細(xì)菌可以致病1876傳染病的

7、微生物病因?qū)W病因?qū)W - 疾病的病因建立 “科學(xué)規(guī)則” 來確定微生物和疾病的病因和效應(yīng)關(guān)系Kochs 原理19Koch確定了3個重要疾病的病因 1. 霍亂 (fecal-oral disease)Vibrio cholerae2. 結(jié)核病 (pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis3. 炭疽(sheep and cattle)Bacillus anthracis20結(jié)核病Figure 24.9結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌. 可以在人與人之間傳播牛型結(jié)核桿菌: 美國的病例數(shù),不在人與人之間傳播鳥胞內(nèi)分枝桿菌，可以感染 AIDS晚期患者21分辨率和對比

8、度人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體22光學(xué)顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必須落在視網(wǎng)膜上不同的感光細(xì)胞上;顯微鏡下,光線經(jīng)過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實(shí)像,然后經(jīng)目鏡折射成正立放大的虛像;經(jīng)顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),以達(dá)到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；23電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌24生理?xiàng)l件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷 原因：細(xì)菌表面帶有正負(fù)電荷的基團(tuán)，等電點(diǎn)多在PH以下，因此在中性或堿性條件下細(xì)菌的表面往往帶有

9、大量負(fù)電荷25染色反應(yīng)Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore)堿性染料 著色基團(tuán)帶正電荷dye+ Cl-酸性染料 著色基團(tuán)帶正電荷Na+ dye-26分枝桿菌涂片鏡檢基本原理、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌、分枝桿菌的特殊結(jié)構(gòu)決定了染色方法：染色劑 細(xì)菌表面帶負(fù)電荷,與堿性復(fù)紅易于結(jié)合,加熱 加深分枝桿菌著色程度脫色 為了易于鏡檢，應(yīng)該使抗酸菌以外的所有物質(zhì)近乎完全脫色復(fù)染 提供一個良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但不掩蓋抗酸菌。而且，復(fù)染既

10、要使涂片的背景易于鏡檢時(shí)調(diào)焦，同時(shí)又不能太深以至分散太多注意力27結(jié)核菌感染及排出示意圖28結(jié)核病29結(jié)核病30細(xì)胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質(zhì)雙分子肽聚糖MYCOLATElipid + LPSporinsacyl lipidsarabinogalactaLAM31細(xì)胞膜兩種主要結(jié)構(gòu)成分雙層磷脂double layer of phospholipids蛋白質(zhì)proteins3233 Cell Membrane341. 痰涂片操作程序原理2. 二甲苯問題35 假陰性 假陽性技術(shù)錯誤 涂片: 太薄/太厚、暴露在紫外線下 標(biāo)本中的混雜物質(zhì) / 加熱時(shí)間過長 / 使用污染的木簽 染色: 染色

11、質(zhì)量不佳、未熱染、染色時(shí) 結(jié)晶/環(huán)境抗酸菌、 間太短、脫落、涂片未固定 交叉污染 脫色: 脫色不佳 脫色不佳 復(fù)染: 過染 染色不佳鏡檢員 視力缺陷、僅觀察少數(shù)視野、 經(jīng)鏡油交叉污染讀片錯誤： 未經(jīng)培訓(xùn) 未經(jīng)培訓(xùn)記錄/報(bào)告： 記錄錯誤 記錄錯誤產(chǎn)生錯誤結(jié)果的常見原因36細(xì)菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiological investigations 影像學(xué)標(biāo)本分泌物 標(biāo)本 37實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)38OUTLINE細(xì)菌學(xué)診斷 顯微鏡檢查術(shù) 培養(yǎng)免疫學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷 Gen Probe 噬菌體檢測方法 HPLC 其他39結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷培養(yǎng)on pla

12、tes or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 藥敏血清學(xué)DNA 方法by disc diffusion methods, breakpoints or MICs 40顯微鏡檢查Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct, e.g. auramineImmunofluorescence41培養(yǎng)Solid media

13、Agar platesFor IdentificationFor EnumerationSlopesFor safe long-term culture, e.g. Lowenstein-Jensen media for TBLiquid media (broth)For enrichment or maximum sensitivity42菌種鑒定形態(tài)學(xué)生長條件生化反應(yīng)酶抗原分子生物學(xué)方法43非培養(yǎng)的診斷方法血清學(xué)檢測分子生物學(xué)方法其他（HPLC） 44什么是分子生物學(xué)診斷方法 ?為什么用分子生物學(xué)診斷方法 ?可得的分子生物學(xué)方法?2022/7/2545討論的議題45分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法

14、的必要補(bǔ)充顯微鏡檢查有假陽性 - T.vaginalis, N.gonorrhoeae胞內(nèi)致病菌 viruses, M.genitalium 低敏感性 Chlamydia sp.,Neisseria sp.慢速生長 M. tuberculosis 46分子生物學(xué)方法 如何發(fā)揮作用?每個微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學(xué)方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定47分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法雜交的互補(bǔ)序列方法擴(kuò)增合成種屬特異的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A

15、-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-48PCR 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理DNA 準(zhǔn)備 潔凈屋儲存溶液混合點(diǎn)熱循環(huán)和擴(kuò)增 檢測 QC & QA質(zhì)量控制 和質(zhì)量保證 R & DAlternatives: - commercial kits - robots + kitsNo alternative49 Bactec放射呼吸測定 以含有放射標(biāo)記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報(bào)告可縮短為4一12天。 分枝桿

16、菌生長指示管法 Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復(fù)合物代替放射性標(biāo)記，其熒光衰減與細(xì)菌代謝過程中O2的消耗量有關(guān)。熒光衰減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。Bactec呼吸測定50流式細(xì)胞儀測定法 原理: 分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復(fù)合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經(jīng)FCM即可檢測到。51比色法 MTT法 MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細(xì)胞還原形成不溶性的Formazan產(chǎn)物,其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。Formazan經(jīng)溶解后，可在酶標(biāo)儀上測定其光吸收值。 微孔板美蘭比色法 美蘭

17、為耗氧指示劑，有氧時(shí)為藍(lán)色，無氧時(shí)為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細(xì)菌，培養(yǎng)基中加入抗結(jié)核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細(xì)菌為藥物敏感株，可被加入的抗結(jié)核藥物抑制或殺死，首先表現(xiàn)為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨(dú)立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細(xì)菌的生長狀態(tài)。52噬菌體生物擴(kuò)增法 將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體用特異的杭噬菌體物質(zhì)滅活，進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體得到保護(hù)而復(fù)制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產(chǎn)生。蝕斑的數(shù)量與噬菌體數(shù)量有關(guān)

18、，也與在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基上存活的結(jié)核分枝桿菌數(shù)有關(guān)。噬菌體法（Fast flaque)53噬菌體熒光素酶檢測法 Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)敕种U菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細(xì)胞內(nèi)ATP存在的條件下，可產(chǎn)生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產(chǎn)生光子，敏感菌和死亡菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生后不能維持。 54 噬菌體生物擴(kuò)增法原理示意圖55Gen Probe 方法檢測結(jié)核分枝桿菌1.原理2.菌種鑒定56RNA/RNA錯配法 Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該法是基于雙鏈RN

19、A能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。將待檢菌株以及藥物敏感的參考菌株(H37Rv)的PCR產(chǎn)物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通過轉(zhuǎn)錄形成兩條RNA，在進(jìn)行雜交，若待檢測株為敏感株，則形成兩條互補(bǔ)的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待檢測菌株有突變發(fā)生，則不能與參考株RNA鏈完全配對，加入RNA酶后，雜交產(chǎn)物將在突變位點(diǎn)被切開，通過電泳即可檢測到。 57RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhaugDanishPragueGlaxoTiceFrappierConnaughtPhippsPasteur分枝菌酸(HPLC)AlphaMethoxyKeto300 bp

20、200 bp100 bpBehr et al. J Bacteriol, 200058DNA 測序法Hirano等應(yīng)用DNA測序法 DNA測序法被認(rèn)為是檢測變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。利用PCR法擴(kuò)增待檢基因，PCR產(chǎn)物可直接測序，24一48h即可提供精確序列，并準(zhǔn)確判定堿基突變的位點(diǎn)，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。59基因芯片 基因芯片 將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標(biāo)記到芯片上，從而快速的檢測出突變位點(diǎn)，可以在3個小時(shí)內(nèi)完成。 60基因組學(xué)的問題多樣性 單核苷酸多態(tài)性,復(fù)制子,缺失,重排株水平差異和種屬特異性基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的主要是根據(jù)同類中的功能來推論翻譯成效應(yīng)分子信息如何引導(dǎo)診斷、預(yù)防、治療疾病61M. tuberculosis H37Rv 440萬堿基對 3924 預(yù)測基因 65.6