真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略課件

1、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略2022/7/28真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧；二、基因組文庫的建立與篩選；三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中 的應(yīng)用；四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略；五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略 真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括： 酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)、杜氏鹽藻生物反應(yīng)器等五種表達(dá)系統(tǒng)。 其中應(yīng)用最廣泛的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體

2、系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種, 其中Pichia Pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。由于它具有無可匹敵的高表達(dá)特性,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)酵母長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè), 不會(huì)產(chǎn)生毒素

3、, 安全可靠; 酵母是真核生物, 能進(jìn)行一些表達(dá)產(chǎn)物的加工, 有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性; 外源基因在酵母中能分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外不僅有利于純化, 而且避免了產(chǎn)物在胞內(nèi)大量蓄積對(duì)細(xì)胞的不利影響; 遺傳背景清楚, 容易進(jìn)行遺傳操作; 較為完善的表達(dá)控制系統(tǒng), 如PMA1 和PDR5 等強(qiáng)啟動(dòng)子可以介導(dǎo)目的蛋白高水平表達(dá), 表達(dá)蛋白的豐度可以達(dá)到膜蛋白的10%; 真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)此外, 采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子可以在時(shí)間上嚴(yán)格控制目的蛋白的表達(dá), 如GAL1- 10( 半乳糖誘導(dǎo)) 、PH05( 胞外無機(jī)磷誘導(dǎo)) 和HSE( 37溫度誘導(dǎo)) ; 生長繁殖迅

4、速, 培養(yǎng)周期短, 工藝簡(jiǎn)單, 生產(chǎn)成本低。酵母菌用于真核基因的表達(dá)、分析, 既具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長迅速、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn), 又具有類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾過程, 因而特別適用于大量生產(chǎn)真核重組蛋白, 正是由于有這些優(yōu)點(diǎn), 使酵母功能基因組的研究得以走在生物功能基因組研究的前列, 是應(yīng)用最為普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸

5、化等,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%;可表達(dá)非常大的外源性基因(200kD);具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力;對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白,但成本較高。近年來,研究者們主要通過改造宿主細(xì)胞和基因?qū)敕椒▉硖岣咄庠吹鞍椎谋磉_(dá)效率。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有

6、CHO、COS、BHK、SP2 /0、N IH3T3等。將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法,主要有化學(xué)法、電穿孔法、基因槍法和哺乳動(dòng)物病毒載體系統(tǒng)等。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或內(nèi)源性的基因?qū)氲街参矬w內(nèi),使植物的遺傳性狀改變而產(chǎn)生的植物體。 轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器已在藥物蛋白的生產(chǎn)中被廣泛使用,成功表達(dá)的藥用蛋白質(zhì)和多肽有:人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體等. 煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗,也得到了人們的廣泛關(guān)注。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要

7、有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物病毒瞬時(shí)高效表達(dá)載體和植物葉綠體高效表達(dá)系統(tǒng)。 在研究成功的轉(zhuǎn)基因植物藥用蛋白中, 80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。在重組藥物的多種表達(dá)體系中,轉(zhuǎn)基因植物是最經(jīng)濟(jì)的。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的2% -10% ,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的0.1%。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略杜氏鹽藻生物反應(yīng)器杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類,沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)外僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜，具有一個(gè)杯狀、大型的葉綠體,體積約占細(xì)胞的一半。 鹽藻是極其耐鹽的，可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化鈉的極端環(huán)境中生存。鹽藻屬于光和自養(yǎng)生物,

8、能利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，富含胡蘿卜素、甘油、蛋白質(zhì)等。鹽藻作為新型的真核生物反應(yīng)器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟(jì)廉價(jià)、簡(jiǎn)單有效、安全可靠等特點(diǎn)。由于它能在高鹽條件下培養(yǎng)，所以不會(huì)污染其他的微生物，這點(diǎn)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞所不及的。外源基因在鹽藻中的表達(dá)主要是集中在cat、bar、gus和egfp等報(bào)告基因上,大多為瞬時(shí)表達(dá)。目前,只有乙肝表面抗原(HbsAg)和篩選標(biāo)記bar基因能夠在鹽藻中穩(wěn)定表達(dá)。 鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。 研究者們正從強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選、高效轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、最佳轉(zhuǎn)化方法的確立等幾方面努力，目前已經(jīng)取得了一定的成果。真核表達(dá)系統(tǒng)

9、的選擇和高效表達(dá)策略巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白,是由于畢赤酵母具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):(1) 能夠快速繁殖和進(jìn)行高密度培養(yǎng);(2) 具有強(qiáng)啟動(dòng)子- 乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動(dòng)子,并且能 夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá);(3) 可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行類似真核的加工折疊和翻譯后修 飾,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性;(4) 表達(dá)產(chǎn)量高,雜蛋白少,并且能夠胞外分泌表達(dá),容易分 離提純;(5) 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,成本低。 畢赤酵母與最早研究的釀酒酵母相比,能夠高密度培養(yǎng),容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化,并且不存在釀酒酵母的過度糖基化問題,也不易產(chǎn)生免疫原性問題。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略巴斯德畢赤酵

10、母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母菌株：一般用于外源基因表達(dá)的Pichia pastoris菌株有Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168等. 根據(jù)利用甲醇的能力, 可將巴斯德畢赤酵母分為3 型: Mut + 型為甲醇快利用型, 此型畢赤酵母具有完整的AOX1 和AOX2 基因, 絕大多數(shù)畢赤酵母為Mut + 表型。 Muts 型,此型畢赤酵母菌(如KM71) 細(xì)胞AOX2 基因編碼的醇氧化酶可產(chǎn)生15%AOX活性,為甲醇慢利用型。Mut-型(如M2G10023) , 此型畢赤酵母AOX1 及AOX2 基因均被敲除,為甲醇不利用型。研究發(fā)現(xiàn), 蛋白酶

11、缺陷型畢赤酵母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源目的蛋白的酶解。 一般說來,蛋白胞內(nèi)表達(dá)時(shí),優(yōu)先考慮用Muts 表型,對(duì)于分泌表達(dá),Mut+和Muts都可使用。甲醇慢利用型有時(shí)比Mut+ 型菌株能夠達(dá)到更高的表達(dá)量。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略Pichia pastoris表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體包括自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體，但以整合型載體為主。常見的整合載體又分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)2類。胞內(nèi)表達(dá)的載體有pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHILD2、pPICZA、pPICZAB和pPICZAC等； 分泌

12、表達(dá)的載體有pPIC9、pPIC9K、pACO815、pPICZA（B、C）和pHILS1等。通用的整合載體多含有AOX1啟動(dòng)子，有一個(gè)外源基因表達(dá)框、多克隆位點(diǎn)（MCS）和一個(gè)從AOX1基因上拷貝下來的終止序列（TT），作為篩選標(biāo)記的his4 基因和在細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記（如ColE1復(fù)制起始點(diǎn)和抗氨芐青霉素基因）以及AOX13端的非編碼區(qū)序列，使外源基因能以同源重組的方式整合到染色體的AOX1部位。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)與功能真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略畢赤酵母表達(dá)載體的啟動(dòng)子Pichia pastoris 含有兩個(gè)基因編碼醇氧化酶:AO

13、X1和AOX2 ,二者序列有92 %同源性,但是AOX1表達(dá)水平高于AOX2。AOX1 啟動(dòng)子的表達(dá)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控。 以甲醇為碳源生長時(shí),約5%的mRNA由AOX1 基因轉(zhuǎn)錄。 PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子) 是最近在畢赤酵母中克隆到的一個(gè)組成型啟動(dòng)子,GAP 啟動(dòng)子不需甲醇誘導(dǎo),發(fā)酵工藝更為簡(jiǎn)單.。Vassilen 利用GAP 啟動(dòng)子表達(dá)乙肝表面抗原獲得高表達(dá), Genzyme 也利用GAP 啟動(dòng)子表達(dá)人幾丁質(zhì)酶,不僅獲得高表達(dá),而且還可以避免蛋白酶水解。 此外，Phongdara 在Hansenul apolymorpha克隆到酸性磷酸酶(p HO1) 基因啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子豐富了甲

14、醇酵母對(duì)啟動(dòng)子的選擇。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記一般為對(duì)應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因, 常用his4 , 也可用來源于釀酒酵母的arg4基因和suc2基因. kanr基因和Shbler 基因（Zeocin抗性基因）也能夠作為細(xì)菌和酵母菌的選擇標(biāo)記，并且攜帶這兩個(gè)標(biāo)記的表達(dá)載體較其他表達(dá)載體更易于篩選。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略信號(hào)肽序列可供畢赤酵母選擇的信號(hào)肽有外源蛋白自身的信號(hào)肽和酵母本身的信號(hào)肽. 有些蛋白的自身信號(hào)肽不能被畢赤酵母有效利用,可試用甲醇酵母信號(hào)肽。目前可供選擇的酵母信號(hào)肽有2交配因子的前導(dǎo)肽序列、酸性磷酸酶信號(hào)肽和蔗糖酶信號(hào)

15、肽等。其中釀酒酵母 2交配因子前導(dǎo)肽序列的使用最為廣泛。 酶切割位點(diǎn)周圍氨基酸序列及外源蛋白的3 級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響信號(hào)肽的加工效率。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略畢赤酵母表達(dá)載體的種類Invitrogen 公司開發(fā)出了若干系列的表達(dá)載體可供選擇。當(dāng)前常用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可分為2 類. 胞內(nèi)表達(dá)載體。如pHIL2D2 ,pAO815 ,p PIC3 K,PICZ , pHWO10 , pGAPZ. 分泌表達(dá)載體。如p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZ,p GAPZ。目前主要采用酵母內(nèi)源性的信號(hào)肽來引導(dǎo)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分泌, 常用2 因子信號(hào)肽。許多蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加

16、工(如糖基化等) 都是在分泌途中完成的。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略外源基因的轉(zhuǎn)化及整合將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，其常用的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法,其中電轉(zhuǎn)化法最為方便,轉(zhuǎn)化效率最高,最容易產(chǎn)生多拷貝整合. Zeocin 抑制細(xì)胞壁的形成,因此pPICZ 系列不能使用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí),載體DNA 必須切成線狀才能與染色體進(jìn)行同源重組,將整個(gè)載體連同外源基因整入宿主染色體. 通常有以下幾種整合方式: 雙位點(diǎn)互換。發(fā)生在染色體AOX1 位點(diǎn)和表達(dá)質(zhì)粒中的PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū),產(chǎn)生的表達(dá)菌的表型為His+Mut-。AOX1單

17、位點(diǎn)互換。發(fā)生在染色體和表達(dá)質(zhì)粒的AOX1 區(qū)。產(chǎn)生的表型是His+Mut+。 His 單位點(diǎn)置換。發(fā)生在染色體His 位點(diǎn)和表達(dá)質(zhì)粒的His 位點(diǎn),使得1 個(gè)或多個(gè)表達(dá)單位插入在His 位點(diǎn),產(chǎn)生的表型也是His+Mut+。巴斯德畢赤酵母載體在宿主染色體上大多為單拷貝整合,由于PAOX1 的強(qiáng)啟動(dòng)性和整合后的穩(wěn)定性, 所以單拷貝也能獲得較高的產(chǎn)量。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略重組蛋白翻譯后修飾Pichia pastoris 能進(jìn)行與高等真核細(xì)胞相似的許多翻譯后修飾,包括二硫鍵形成、信號(hào)序列加工、折疊、O-連接和N-連接糖基化等。巴斯德畢赤酵母對(duì)分泌的外源蛋白的糖基化已成為研究的熱點(diǎn)。巴斯

18、德畢赤酵母對(duì)外源目的蛋白的糖基化作用具有2個(gè)主要特征: 極少出現(xiàn)過度糖基化。一般情況下畢赤酵母能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型寡糖鏈,且較均一,長度在814 個(gè)之間,使產(chǎn)物更加穩(wěn)定。糖鏈中不含具有潛在致敏作用的-1,3-甘露糖。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略影響外源基因表達(dá)的因素影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括:外源基因自身的特性、外源基因整合的拷貝數(shù)、外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信號(hào)、產(chǎn)物穩(wěn)定性、翻譯后修飾以及培養(yǎng)條件等。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略外源基因自身的特性外源基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。特定的（A+T）富含區(qū)可作

19、為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，導(dǎo)致僅產(chǎn)生低水平或截短的mRNA。某些稀有密碼子，尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率的因素。在某些情況下，可通過定點(diǎn)突變?nèi)コ墒烨敖K止結(jié)構(gòu)域和替換稀有密碼子。但在更極端的情況下，即基因中存在大量（A+T）富含區(qū)和稀有密碼子密集區(qū)時(shí)，往往需要進(jìn)行全基因合成，使編碼序列符合畢赤酵母偏愛性密碼子用法和更高的（G+C）含量。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略載體的構(gòu)建通過選擇添加前導(dǎo)肽,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表達(dá)也可以分泌到胞外。由于有些蛋白在胞內(nèi)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,或者因?yàn)楫a(chǎn)物濃度高引發(fā)細(xì)胞一些自發(fā)的調(diào)節(jié)抑制表達(dá),所以一般先嘗試胞外分泌表達(dá), 同時(shí)可以減少下游的

20、純化工序。如果采用胞外表達(dá)便需要在載體中使用信號(hào)肽。一般來說使用的都是來自釀酒酵母的因子信號(hào)序列,含因子的載體已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化,很多外源蛋白能夠通過因子成功胞外分泌表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)因子信號(hào)序列的分泌能力在很多例子中比其他前導(dǎo)肽強(qiáng),而且其他一些前導(dǎo)肽(如PHO1)只能分泌到膜周質(zhì),存在缺陷,而外源基因自帶的信號(hào)肽一般在畢赤酵母中表達(dá)效率很低甚至不分泌。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略載體的構(gòu)建但如果使用因子時(shí)蛋白得不到表達(dá),應(yīng)裂菌后再次檢測(cè)目的蛋白。如果是前導(dǎo)肽的問題,就需要更換信號(hào)肽,如改用殺傷毒素的信號(hào)序列、菊粉酶的信號(hào)肽( ISP)序列。暫時(shí)沒有證據(jù)表明哪種信號(hào)肽對(duì)于具體哪一種蛋白的表達(dá)是

21、最有效的,只能通過實(shí)驗(yàn)來確定最后使用的信號(hào)肽。因子信號(hào)序列的切割位點(diǎn)Kex2在AGA和GAG之間,如果表達(dá)的蛋白要求維持N端的天然序列,需要在AGA后面直接插入目的基因。有報(bào)道表明AGA后面的蛋白序列會(huì)對(duì)因子信號(hào)序列的切割有影響,并且某些表達(dá)蛋白也會(huì)保護(hù)自身免受某些切割反應(yīng),通常當(dāng)Kex2位點(diǎn)后面的氨基酸殘基比較小時(shí),對(duì)切割的影響不大。還有報(bào)導(dǎo)在目的產(chǎn)物前面加入全前導(dǎo)肽序列(pre - pro)提高了切割效率,從而提高分泌表達(dá)的產(chǎn)量。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)巴斯德畢赤酵母中的穩(wěn)定高效表達(dá)主要通過整合性載體實(shí)現(xiàn)。整合性載體的表達(dá)盒穩(wěn)定,可以多位點(diǎn)整合而獲得多拷

22、貝以及進(jìn)行不同整合方式。 AOX1和組氨酸脫氫酶( HIS4) 基因位點(diǎn)都已被成功用于表達(dá)外源蛋白. Sreekrishna 等認(rèn)為,由于表達(dá)框中his4染色體突變拷貝與完好的his4 基因能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)換,所以首選Aox1位點(diǎn)作為整合位點(diǎn)。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略宿主菌的甲醇利用表型原則上,如果是胞內(nèi)表達(dá),應(yīng)盡量用Mut-細(xì)胞,這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而蛋白純化更易進(jìn)行.?，F(xiàn)在無需甲醇誘導(dǎo)的組成性表達(dá)載體pGAPZ和pGAPZ已經(jīng)構(gòu)建成功,它們常能生產(chǎn)比誘導(dǎo)型載體pPICZ 和pPICZ更高的外源蛋白。Doring 等研究表明,在生產(chǎn)哺乳動(dòng)物膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí),pGAP 比p

23、AOX1 更理想。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選通常增多轉(zhuǎn)化子攜帶外源基因的拷貝數(shù)能夠在一定程度上提高表達(dá)量,因此篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子來提高產(chǎn)量是一個(gè)簡(jiǎn)單容易實(shí)施的策略。常用的方法是使用帶有抗性標(biāo)記的載體,通過工程菌對(duì)抗生素的耐受力的不同來進(jìn)行多拷貝篩選,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多。商業(yè)化的抗性標(biāo)記有卡那霉素抗性基因(在酵母中耐受G418) ,細(xì)菌shble基因(在酵母中耐受Zeocin) 。此外還可以使用攜帶多拷貝表達(dá)盒的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子。國外也有報(bào)導(dǎo)在大腸桿菌引入轉(zhuǎn)座子,在大腸桿菌階段利用抗生素濃度篩選攜帶多拷貝目的基因的質(zhì)粒。然而也有不少實(shí)驗(yàn)表明

24、,拷貝數(shù)越多并不一定意味表達(dá)量越大,如果要確定多拷貝策略對(duì)提高特定目的基因產(chǎn)量是否有效,需要同時(shí)篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對(duì)兩者進(jìn)行產(chǎn)量對(duì)比才能得到影響結(jié)果。通常采取利用酵母轉(zhuǎn)化子耐受的最高抗生素濃度的方法快速粗略判定拷貝的數(shù)目。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略基因劑量一般來說,高拷貝整合可以提高表達(dá)量, 如Jeffrey 等發(fā)現(xiàn), 重組CD40L 的最高產(chǎn)量是在有8 個(gè)以上拷貝的菌株中獲得。但許多實(shí)例表明,含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量。個(gè)別情況下拷貝數(shù)增加對(duì)產(chǎn)量也會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng),原因可能在于過高表達(dá)會(huì)對(duì)分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制。因此,高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn),基

25、因劑量與表達(dá)水平的關(guān)系取決于特定的外源蛋白。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略分泌信號(hào)不適合的信號(hào)肽可導(dǎo)致信號(hào)肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌。嘗試不同的信號(hào)肽,對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行突變改造或人工全合成信號(hào)肽等策略可用于實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽正確加工和提高分泌水平。. 韋宇拓等利用菊粉酶的信號(hào)肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達(dá)了B2葡聚糖酶,結(jié)果表明ISP 信號(hào)肽序列分泌效率不低于利用因子信號(hào)肽的表達(dá)載體pPIC9 K。Singh 等通過定向缺失誘變導(dǎo)致了含有天然N 端的成熟干擾素的正確釋放,可以成為解決這一問題的一種好方法。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略培養(yǎng)條件的優(yōu)化畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個(gè)表型,其中Mut+能夠快速利用甲醇,MutS利用得慢