rol基因與植物次生代謝教學(xué)教材

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。rol基因與植物次生代謝-rol基因?qū)χ参锎紊x的影響摘要：Ri質(zhì)粒不同于Ti質(zhì)粒，僅存在于發(fā)根農(nóng)桿菌中的另一類(lèi)可作為植物基因工程載體的質(zhì)粒，其上的T-DNA片段可以整合進(jìn)入被發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的雙子葉植物細(xì)胞的核基因組中，并穩(wěn)定地遺傳下去，產(chǎn)生的表型為植物發(fā)根瘤和再生轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)和發(fā)育異常，控制毛根形成的是T-DNA上的rol基因，rol基因不存在于Ti質(zhì)粒上。本文介紹了rol基因?qū)χ参锎紊x中的功能，以及rol基因在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。關(guān)鍵詞：rol基因；次生代謝；發(fā)根農(nóng)桿菌1發(fā)根農(nóng)桿菌和Ri質(zhì)粒發(fā)

2、根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是根瘤菌科(Rhizoliacea)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，外形呈桿狀，具鞭毛，能侵染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物及少數(shù)單子葉植物，在侵染部位能形成大量生長(zhǎng)快、分枝多、失去向地性的不定根，稱(chēng)為毛狀根(hairyroot)。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應(yīng)用的植物基因工程技術(shù)，在植物代謝物的生產(chǎn)上顯示了巨大的應(yīng)用潛力。發(fā)根農(nóng)桿菌在植物生物技術(shù)研究中，尤其是在遺傳育種和基因工程研究中，發(fā)揮了極其重要的作用。Ri質(zhì)粒具有兩個(gè)主要的功能區(qū)即T-DNA(轉(zhuǎn)移區(qū))和Vi

3、r(致病區(qū))，它通過(guò)T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染植物中，使其生成毛狀根。T-DNA在植物細(xì)胞基因組的整合和表達(dá)，導(dǎo)致毛狀根的發(fā)生和再生轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育異常。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體合成冠癭堿(Opines)的不同，可將發(fā)根農(nóng)桿菌及其Ri質(zhì)粒分為四種類(lèi)型：農(nóng)桿堿型(agropine-type)、甘露堿型(mannopine-type)、黃瓜堿型(cucronopine-type)和異黃瓜堿型(mikimopine-type)。農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的T-DNA有兩個(gè)邊界區(qū)域，即TL-DNA區(qū)和TR-DNA區(qū)，兩個(gè)區(qū)域之間為一個(gè)非插入的DNA區(qū)。TL-DNA上存在與根的形態(tài)有關(guān)的基因，同時(shí)TL-DNA也影響再生

4、植株的莖、葉的形態(tài)和一些生理性狀。TR-DNA上有生長(zhǎng)素合成基因tms1和tms2，指導(dǎo)IAA的合成，因此轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根。甘露堿型、黃瓜堿型和異黃瓜堿型Ri質(zhì)粒只有單一邊界的T-DNA，與農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的TL-DNA有較高的同源性。農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的TL-DNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中整合的長(zhǎng)度是相當(dāng)固定的，而農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的TR-DNA整合的長(zhǎng)度有很大變化。此外，在轉(zhuǎn)化的毛狀根克隆中可以有多個(gè)T-DNA整合，這些T-DNA或者獨(dú)立存在(非連鎖)，或者位于同一染色體上(連鎖)。多T-DNA整合現(xiàn)象可能是多菌轉(zhuǎn)化的結(jié)果，也可能是同一細(xì)菌向單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入多個(gè)T-DNA的結(jié)果。2rol基因Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿

5、菌中位于染色體DNA之外的獨(dú)立基因組，是僅存在于發(fā)根農(nóng)桿菌中的另一類(lèi)可作為植物基因工程載體的質(zhì)粒，為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA。目前農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒比較常見(jiàn)，rol基因是位于Ri質(zhì)粒上T-DNA區(qū)的基因群(包括rolA、B、C、D基因)。現(xiàn)已證實(shí)，rolB基因和rolC基因是誘導(dǎo)植物生根的最主要基因。2.1rolA基因RolA蛋白是DNA結(jié)合蛋白中的一員，在結(jié)構(gòu)上與乳頭瘤病毒E2DNA結(jié)合域有很大的相似性。到目前為止RolA蛋白的生物化學(xué)功能尚不清楚。對(duì)rolA基因的研究表明，rolA基因能夠刺激尼古丁生成。在茜草(Rubiacordifolia)愈傷組織中表達(dá)rolA基因，能夠使醌類(lèi)化合物(AQ

6、s)的水平提到2.8倍，同時(shí)通過(guò)長(zhǎng)達(dá)7年的觀察發(fā)現(xiàn)，rolA的表達(dá)也為愈傷提供了一個(gè)很好的生長(zhǎng)環(huán)境。然而這些數(shù)據(jù)還不足以來(lái)就rolA對(duì)植物次生代謝的作用下定論。2.2rolB基因在rol基因家族中，rolB是對(duì)植物次生代謝最有影響的基因，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的擬制作用也是最強(qiáng)的。在轉(zhuǎn)基因茜草的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)，rolB的表達(dá)水平與異分支酸合酶的表達(dá)水平成正相關(guān)，異分支酸合酶是合成AQ的一個(gè)關(guān)鍵酶，rolB通過(guò)影響異分支酸合酶來(lái)影響著AQ的生成。對(duì)茜草愈傷組織的生長(zhǎng)參數(shù)的觀察發(fā)現(xiàn)，rolB的高表達(dá)水平對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)起擬制作用。有意思的是，rolA、rolC對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)并沒(méi)有擬制作用，當(dāng)rolB與rol

7、A、rolC一起在愈傷組織中表達(dá)時(shí)，rolB的擬制作用被擬制了。與rolA和rolC相比，rolB對(duì)AQ積累的作用更大。在高水平表達(dá)rolB的組織中rolB能使AQ的水平提高15，然而在rolA、rolB和rolC一同表達(dá)的組織中，AQ的合成就少多了。在轉(zhuǎn)rolB細(xì)胞中，擬制生長(zhǎng)是一個(gè)限制因素，因?yàn)閞olB編碼一個(gè)具有酪氨酸磷酸化活性的蛋白，當(dāng)通過(guò)使用酪氨酸磷酸酶擬制劑時(shí)，該擬制劑能阻止rolB對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的的毒害作用時(shí)，同時(shí)細(xì)胞中的次生代謝也隨之降低。此外也報(bào)到rolB對(duì)植物次生代謝有促進(jìn)作用。rolB對(duì)植物次生代謝有促進(jìn)作用最早是在轉(zhuǎn)rolB山葡萄細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，在轉(zhuǎn)rolB山葡萄細(xì)胞中，ro

8、lB的轉(zhuǎn)錄水平比野生型山葡萄高，并且白藜蘆醇的積累量比野生型細(xì)胞的高100倍。白藜蘆醇是一類(lèi)重要的對(duì)稱(chēng)二苯代乙烯，能在腫瘤的引發(fā)、發(fā)展中阻止致癌作用。rolC基因rolC能刺激植物合成烷類(lèi)生物堿、吡啶生物堿、植物堿、皂苷類(lèi)化合物、醌類(lèi)化合物。在轉(zhuǎn)rolC基因植物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，rolC的表達(dá)量與尼古丁的產(chǎn)量和植物根的生長(zhǎng)速度和密切相關(guān)。曾經(jīng)有人提出了rolC刺激植物堿的合成是通過(guò)刺激植物的生長(zhǎng)，而不是直接通過(guò)刺激根的合成活性的假說(shuō)。然而在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，rolC能刺激植物根合成植物堿。在不同種的植物，rolC刺激植物堿合成的活性不一樣。在茜草轉(zhuǎn)化的愈傷組織，rolC基因的表達(dá)導(dǎo)致了蒽醌含量的穩(wěn)定增

9、加，與非轉(zhuǎn)基因植物相比激活的程度為1.31.8倍的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物長(zhǎng)時(shí)間栽培觀察（5年以上）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)rolC基因植株胼胝體中AQs的積累比非轉(zhuǎn)基因植物的高2.04.3倍多。這表明隨著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)rolC基因植物中AQs的積累能夠保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平上（Shkryl等人,2007）。研究還發(fā)現(xiàn)蒽醌類(lèi)化合物的合成和ICS的基因的表達(dá)都依賴(lài)于rolC的表達(dá)強(qiáng)度：rolC基因的表達(dá)越高，ICS基因的表達(dá)和AQs的積累也越高。rolC基因提供了一個(gè)激活植物次生代謝過(guò)程的信號(hào)。除了刺激植物次生代謝外，rolC可能還賦予了植物更廣泛的防御反應(yīng)。在人參細(xì)胞中rolC的表達(dá)與-1,3-葡聚糖酶（P

10、R2家族）基因表達(dá)相一致。rolD基因rolD基因?qū)Υ紊x的影響還未開(kāi)始研究，RolD蛋白是Rol蛋白中生化功能唯一明確的一個(gè)蛋白?；谏镄畔W(xué)數(shù)據(jù)和直接的生化方法，Trovato等（2001）發(fā)現(xiàn)，rolD編碼鳥(niǎo)氨酸環(huán)化脫氨酶，該酶能將鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)換到脯氨酸上。在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，鳥(niǎo)氨酸池的減少和脯氨酸池的增加也是由于rolD的形態(tài)影響，比如維護(hù)毛根的生長(zhǎng)和刺激植物開(kāi)花（Trovato等人,2001）。有趣的是，通過(guò)測(cè)量PR-1基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在番茄中表達(dá)的rolD能加強(qiáng)細(xì)胞的防御反應(yīng)。rolA、B和C基因的聯(lián)合效益目前通過(guò)觀察毛狀根（在毛狀根中，基因的表達(dá)是在自己的啟動(dòng)子下控制著）的培養(yǎng)和其它的

11、T-DNA的基因研究了rolA、B和C基因的聯(lián)合效益。這些調(diào)查表明，在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物中毛狀根的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)都有增加。毛狀根產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物的能力是一個(gè)有趣的自然現(xiàn)象，哪一個(gè)T-DNA基因位點(diǎn)導(dǎo)致了這個(gè)結(jié)果？考慮到在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中，T-DNAROL基因位點(diǎn)對(duì)不同的生化過(guò)程有很大的影響，這個(gè)合理解釋是導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的增加的遺傳決定因素是發(fā)根農(nóng)桿菌的rol基因。研究發(fā)現(xiàn)，在不同轉(zhuǎn)rolABC植物根部中次生代謝產(chǎn)物的積累與轉(zhuǎn)野生型的毛狀根中的積累很相似。在最近的調(diào)查顯示，在轉(zhuǎn)rolA、rolB基因和rolC基因，rolABC和pRiA4的茜草細(xì)胞中，每個(gè)rol基因似乎都有各自獨(dú)立的AQ激活

12、機(jī)制?？偟膩?lái)說(shuō)，這些基因在誘導(dǎo)高水平的二級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。雖然不排除還有額外的T-DNA的基因可對(duì)毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的影響，但這些額外基因的影響都很小。以前就有關(guān)于rol基因的拮抗作用就有不同程度的報(bào)道。rolB基因表達(dá)抑制了煙草細(xì)胞增長(zhǎng)，而rolC基因能夠削弱這種增長(zhǎng)抑制作用。同樣，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，rolC基因還減少了由rolB誘導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的敏感程度以及轉(zhuǎn)化表型。有些數(shù)據(jù)表明，rolB和rolC基因的拮抗作用可能是由鈣信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)。這可能是在野生型轉(zhuǎn)化子激活的次生代謝中，rolB基因是一個(gè)重要因素，同時(shí)rolC基因在擬制rolB基因的作用時(shí)具有自己的信號(hào)途徑。r

13、ol基因與植物抗病信號(hào)途徑rol基因生物化學(xué)功能已有很多研究人員對(duì)Rol蛋白的進(jìn)行研究了。早期研究表明，rolB基因和rolC蛋白為葡萄糖苷酶，分別從它們的結(jié)合形式中釋放生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，然而沒(méi)有其他的證據(jù)支持這一假設(shè)，并推斷在轉(zhuǎn)rolC和rolB基因植物中，游離激素水平的變化，反映出致癌基因的非特異性效應(yīng)。最近，F(xiàn)aiss等（1996）提出，RolC作為一種水解的植物細(xì)胞壁的非特異性的葡萄糖苷酶，從而通過(guò)釋放的寡糖干擾植物發(fā)育。到目前為止。還沒(méi)有其他能闡明RolC蛋白生化功能的研究。rolC基因產(chǎn)物的分子量為20.1kDa，但是值得注意的是植物和細(xì)菌葡萄糖苷酶都是相對(duì)分子質(zhì)量高(50200

14、kDa)的蛋白（Slightom等，1985），這些蛋白的分子量都高于RolC蛋白。以硝基苯基-D-吡喃葡糖苷為底物，研究1c未轉(zhuǎn)化和1c不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)rolC基因的愈傷組織培養(yǎng)物中的-D-葡萄糖苷酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，與其他碳水化合物酶相比，在所有的轉(zhuǎn)基因植物中-D-葡萄糖苷酶活性都很低，相反的是在rolC轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，-和-D-牛乳糖和1,3-D-葡聚糖酶的活性都比對(duì)照高310倍。凝膠滲透實(shí)驗(yàn)也表明在分子量為20kDa出的蛋白沒(méi)有-D-葡糖苷酶活性。如果rolC基因產(chǎn)物為葡糖苷酶的話，那么這種酶應(yīng)該是一種新的特異性的酶。rolC基因編碼蛋白質(zhì)的功能與此相反，在RolB蛋白的研究中這有兩大突破

15、。研究發(fā)現(xiàn)RolB蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性（菲利皮尼等人，1996），并與14-3-3蛋白相互作用。反過(guò)來(lái)，這些研究突出了在植物和動(dòng)物中的一個(gè)平行致癌基因，因?yàn)槔野彼崃姿崦负?4-3-3蛋白在哺乳動(dòng)物致癌基因中起著中樞的作用，并參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和死亡等復(fù)雜的過(guò)程。Rol蛋白的酪氨酸磷酸酶功能需要進(jìn)一步研究，因?yàn)樵谄渌鹯olB基因蛋白中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)pRiA4rolB蛋白的CX5R基序中，而這個(gè)的酪氨酸磷酸酶家族特有的基序。也有證據(jù)證明了RolB蛋白參與了次生代謝，并具有酪氨酸磷酸酶功能。在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，酪氨酸磷酸酶抑制劑可以消除rolB基因調(diào)節(jié)的白藜蘆醇和醌類(lèi)化合物的刺激作用。目前對(duì)植物次生代謝

16、中酪氨酸磷酸化和14-3-3蛋白介導(dǎo)的生化過(guò)程還沒(méi)有很清晰的了解。最近的研究表明，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化在植物中起著重要作用，調(diào)節(jié)MAP激酶的，轉(zhuǎn)錄因子的活性和ROS信號(hào)傳導(dǎo)。最近，酪氨酸磷酸酶在植物中的存在也是有爭(zhēng)議的，在擬南芥中有好幾個(gè)蛋白酪氨酸家族。植物細(xì)胞不能產(chǎn)生高水平的白藜蘆醇，加上低效率的標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)方法為在體內(nèi)白藜蘆醇的檢測(cè)造成了很大的問(wèn)題，而rolB基因能刺激生產(chǎn)高含量的白藜蘆醇克服了這個(gè)問(wèn)題。3.2植物信號(hào)傳導(dǎo)與rol基因植物防御激素茉莉酸甲酯、水楊酸和乙烯在植物防御反應(yīng)的中發(fā)揮重要作用。雖然有實(shí)例證明NADPH氧化酶的的途徑不參與植物抗毒素刺激過(guò)程，但是由NADPH氧化酶產(chǎn)生氧

17、化突發(fā)在植物抗毒素刺激過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。藥理實(shí)驗(yàn)表明，rolC和rolB基因在蒽醌產(chǎn)生過(guò)程的作用不依賴(lài)于JA介導(dǎo)和依賴(lài)與Ca2+的NADPH氧化酶途徑。研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)rolC植物和野生型植物細(xì)胞中，乙烯與AQ植物抗毒素的產(chǎn)生無(wú)關(guān)聯(lián)，這也說(shuō)明rolC在蒽醌產(chǎn)生過(guò)程中與乙烯信號(hào)途徑相互獨(dú)立。然而SA以及rolC基因?qū)祯a(chǎn)生具有額外的刺激作用，這也暗示著還有其他刺激AQ生產(chǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在。在野生型或是轉(zhuǎn)rolC和rolB基因茜草中以及轉(zhuǎn)rolC基因E.sericeum的根中，斑蝥素（蛋白磷酸酶1和2A抑制劑）是唯一對(duì)次生代謝有顯著影響的擬制劑。由于蛋白激酶/磷酸酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是激發(fā)子分子識(shí)別和

18、激活植物的防御反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一部分。一種轉(zhuǎn)化的磷酸酶擬制劑能夠誘導(dǎo)一種反應(yīng)，這意味著蛋白的磷酸化在誘導(dǎo)反應(yīng)體系中具有重要作用。在轉(zhuǎn)rolC和rolB基因細(xì)胞中，由于斑蝥素能強(qiáng)烈激活植物次生代謝，致癌基因在刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中斑蝥素敏感的Ser/Thr磷酸酶的表達(dá)非常重要。這些磷酸酶可能是通過(guò)刺激致癌基因在植物抗毒素產(chǎn)生上的刺激作用來(lái)調(diào)節(jié)的。在任何情況下，rolC和rolB基因引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑都有蛋白參與磷酸化/去磷酸化過(guò)程中。rol基因與ROS3.2.1rolB在ROS中的調(diào)節(jié)作用rolB在ROS中的調(diào)節(jié)作用目前還存在著異議。Shkryletal.（2008）發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)rolB的R.cord

19、ifolia植物中蒽醌的含量特別高，特別是在rolB基因轉(zhuǎn)錄水平高的細(xì)胞中，由于rolB基因的壞死作用，因此人們推測(cè)rolB基因能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)物，但是結(jié)果是相反的。Bulgakovetal.（2012）發(fā)現(xiàn)rolB基因能擬制ROS的產(chǎn)生，并且能下調(diào)或是消減ROS水平。也是由于rolB的這個(gè)作用，rolB細(xì)胞具有更高的耐鹽、耐除草劑、耐甲萘醌、耐高壓和H2O2。由于在rolB細(xì)胞，rolB只是上調(diào)部分抗氧化基因，并且還依賴(lài)于rolB基因的表達(dá)強(qiáng)度。因此Bulgakov假設(shè)在轉(zhuǎn)rolB細(xì)胞中，細(xì)胞接受了一個(gè)來(lái)著rolB蛋白的信號(hào)，通過(guò)細(xì)胞補(bǔ)償系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行這個(gè)信號(hào)，準(zhǔn)確地調(diào)整抗氧化系統(tǒng)，當(dāng)這個(gè)系統(tǒng)補(bǔ)償

20、成功時(shí)，細(xì)胞維持著正常的氧化還原平衡，rolB表達(dá)過(guò)量時(shí)，系統(tǒng)補(bǔ)償失敗，導(dǎo)致了植物細(xì)胞壞死。3.2.2rolC在ROS中的調(diào)節(jié)作用在植物的防御反應(yīng)中活性氧（ROS）起著關(guān)鍵的作用。為了闡明次生代謝與活性氧的關(guān)系，研究人員通過(guò)共聚焦顯微鏡和熒光染料的方法對(duì)茜草細(xì)胞進(jìn)行觀察，在轉(zhuǎn)rolC茜草中發(fā)現(xiàn)ROS的穩(wěn)定水平比野生型中的低。ROS的誘導(dǎo)能導(dǎo)致正常細(xì)胞中ROS的增加，但在轉(zhuǎn)rolC細(xì)胞中的誘導(dǎo)效應(yīng)卻很小。這些結(jié)果表明rolC基因是一個(gè)功能強(qiáng)大的活性氧抑制。此外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)rolC基因的細(xì)胞對(duì)鹽、熱和冷的忍受程度要比正常細(xì)胞高23倍。這些數(shù)據(jù)表明，致癌基因能激活多個(gè)效應(yīng)子，并且ROS的產(chǎn)生與植物抗毒素的

21、產(chǎn)生是兩條很明顯分離的途徑。當(dāng)植物反應(yīng)并激發(fā)后，ROS的放大則依賴(lài)于Ca2+離子流。有資料顯示，轉(zhuǎn)rolC和野生型的茜草細(xì)胞對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Ca2+cyt的提高有著明顯的不同，并且ROS的水平與H2O2誘導(dǎo)的Ca2+cyt離子流成正相關(guān)。如果在轉(zhuǎn)rolC細(xì)胞中ROS和Ca2+cyt信號(hào)傳導(dǎo)減弱了，致癌基因可能會(huì)通過(guò)這些重要的信號(hào)分子越過(guò)上游植物控制機(jī)制。3.3調(diào)節(jié)依賴(lài)Ca2+的蛋白激酶基因的表達(dá)在植物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)rolC基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)植物激素的敏感程度、體胚過(guò)渡和鈣失衡以及PR2蛋白的激活和次生代謝。近年來(lái)，很多文章也論證了在根瘤菌微生物中，依賴(lài)Ca2+/鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶和依賴(lài)鈣的蛋白激

22、酶(CDPK)在植物和根癌菌相互作用中起著重要作用。由于發(fā)根農(nóng)桿菌與根瘤菌微生物有關(guān)，因此陳等人提出了一個(gè)合理的假設(shè)：發(fā)根農(nóng)桿菌可以開(kāi)發(fā)一個(gè)類(lèi)似根瘤菌微生物的戰(zhàn)略來(lái)影響宿主植物信號(hào)的分子。由于在調(diào)節(jié)植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑的crosstalk中，CDPK是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子，調(diào)節(jié)CDPK的表達(dá)和/或活性能解釋很多在轉(zhuǎn)rolC基因植物中很難解釋的效應(yīng)。事實(shí)上，最近實(shí)驗(yàn)顯示在人參和Eritrichiumsericeum組織細(xì)胞中表達(dá)rolC能導(dǎo)致CDPK基因表達(dá)的改變，并激活了具有與催化絲氨酸/蘇氨酸激酶子區(qū)域相似的修飾序列轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)生。有趣的是，在轉(zhuǎn)rolC基因的人參，山葡萄和E.sericeum的細(xì)胞

23、中發(fā)現(xiàn)rolC基因表達(dá)水平能誘導(dǎo)CDPK轉(zhuǎn)錄子的縮短或是加長(zhǎng)。因此rolC是通過(guò)改變各種CDPK基因的表達(dá)和產(chǎn)生新的CDPK轉(zhuǎn)錄子來(lái)影響各種生化過(guò)程。此外植物的耐鹽性也是rol基因與CDPK有關(guān)的另一個(gè)例子，植物耐鹽性是由CDPK的活性引起的，與Ca2+離子通道有關(guān)一種特性，當(dāng)加入CDPK擬制劑后，人參細(xì)胞的耐鹽能力明顯下降。由于在轉(zhuǎn)rolB和rolC基因的人參細(xì)胞組織的耐鹽能力也比野生型的高，因此rolB和rolC的表達(dá)必定與CDPK基因的表達(dá)有某種程度的關(guān)聯(lián)。通過(guò)DNA芯片和RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)的人參耐鹽性有關(guān)的CDPK基因有PgCDPK1,PgCDPK2,PgCDPK3和PgCDPK4a

24、。KISELEV（2009）在對(duì)轉(zhuǎn)rol基因的人參細(xì)胞組織進(jìn)行鹽處理的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，人參細(xì)胞組織還有會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫的CDPK基因的表達(dá)，但是這短暫的CDPK基因表達(dá)并不是因?yàn)閞olC基因引起的，而是植物細(xì)胞的一個(gè)自然的反應(yīng)，除了CDPK基因的短暫的上調(diào)之外，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)說(shuō)明CDPKs基因的剪切和RNA編輯。4rolC的長(zhǎng)期持續(xù)的影響有證據(jù)表明，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)會(huì)改變轉(zhuǎn)rol基因細(xì)胞中細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和次生代謝。比如用5個(gè)原始轉(zhuǎn)rolC獨(dú)立的人參轉(zhuǎn)化子，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的繼代培養(yǎng)來(lái)研其根的形成能力，發(fā)現(xiàn)在315月后根才開(kāi)始形成，1年半到5年后這五個(gè)形成了初始的腫瘤組織，并停止了根的形成，開(kāi)始了體細(xì)胞胚胎和

25、根原基的形成。在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)rolC基因的細(xì)胞培養(yǎng)也會(huì)改變。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)7年的茜草愈傷組織中的一項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)rolC基因轉(zhuǎn)化的愈傷組織表型很保守，而且rolC的表達(dá)量很高，AQ水平也都很穩(wěn)定。然而，在轉(zhuǎn)rolC基因愈傷組織中、愈傷組織的生長(zhǎng)參數(shù)發(fā)生了改變。在長(zhǎng)期的培養(yǎng)中，不管rolC基因的表達(dá)高還是低，轉(zhuǎn)rolC基因的愈傷組織的生長(zhǎng)逐漸增加，而對(duì)照愈傷組織生長(zhǎng)維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。在轉(zhuǎn)rolC基因的Eritrichiumsericeum和Lithospermumerythrorhizon中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)對(duì)次生代謝具有明顯擬制作用的現(xiàn)象。在這兩種植物中包含了大量的咖啡酸代謝物和迷迭香酸，這些物質(zhì)都

26、具有很強(qiáng)的去抗腎炎的活性。在這兩種植物的轉(zhuǎn)rolC基因的愈傷組織中，咖啡酸代謝物都比對(duì)照低2到3倍。關(guān)于rolC基因?qū)Υ紊x的擬制作用的結(jié)論是通過(guò)長(zhǎng)達(dá)兩年的基于化學(xué)分析的觀察而得出的，然而在之后的23年的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)rolC基因的Eritrichiumsericeum中迷迭香酸的產(chǎn)量開(kāi)始遞增。在轉(zhuǎn)rolC基因的人參中也得到了相似的結(jié)論。很明顯，當(dāng)rolC基因整合到植物基因組當(dāng)中時(shí)，與時(shí)間相關(guān)的植物生長(zhǎng)、分化和次生代謝能力也發(fā)生了顯著的變化。但是這些效應(yīng)很難解釋?zhuān)环矫嬷饕驗(yàn)橹掳┗蛟诨蚪M中的重排程度尚不清楚，另一方面是依賴(lài)致癌基因的突變程度也是未知的。研究rolC誘導(dǎo)腫瘤的特性具有很重要的

27、生物學(xué)意義，同時(shí)這些特性也與人類(lèi)癌癥基因組的突變過(guò)程相關(guān)的特性相似。5其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑rolB和rolC可能通過(guò)改變植物傳統(tǒng)機(jī)制來(lái)起作用。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明rolC對(duì)植物抗毒素生產(chǎn)依賴(lài)于植物防衛(wèi)素和依賴(lài)鈣的NADPH氧化途徑。與此同時(shí)，在轉(zhuǎn)rolC的茜草細(xì)胞中AQs的生產(chǎn)不依賴(lài)于氧迸發(fā)。rolC和rolB可能通過(guò)短嶄的關(guān)閉來(lái)繞過(guò)上游植物控制機(jī)制和識(shí)別防御反應(yīng)，從而行使它們對(duì)次生代謝調(diào)節(jié)的功能。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌和植物相互作用的進(jìn)化發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)古T-DNA參與了原始的入侵過(guò)程，并且在植物種類(lèi)的分化上起著重要作用。因此我們也可以猜測(cè)rolC影響著重要的植物調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。6問(wèn)題與展望目前rol基因已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用到作物

28、的改良當(dāng)中了，轉(zhuǎn)化Ri質(zhì)粒rol基因的植物不僅在生理代謝上發(fā)生了改變，而且在表型上出現(xiàn)一系列可穩(wěn)定遺傳的變異性狀，包括改變植株的形狀，降低頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)根系形成以及影響開(kāi)花與育性等強(qiáng)烈改變了植物生長(zhǎng)發(fā)育模式的現(xiàn)象。這些為轉(zhuǎn)rol基因提供了理論基礎(chǔ)。然而，在rol基因表達(dá)的性狀中，既有改良目的所需要的，也存在對(duì)育種目標(biāo)不利的性狀，如對(duì)多數(shù)植物導(dǎo)入rolA、B、C基因后，雖然能顯著改善植株的生根能力，但轉(zhuǎn)基因植株常伴隨著頂端優(yōu)勢(shì)減弱，節(jié)間縮短，葉片皺縮等不良性狀。徹底了解rol基因的功能，弄清其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而做到有選擇地控制rol基因的表達(dá)，已成為完善Ri質(zhì)粒載體系統(tǒng)需要解決的問(wèn)題?？梢钥紤]對(duì)

29、rol基因啟動(dòng)子進(jìn)行替換或改造來(lái)實(shí)現(xiàn)選擇性控制rol基因的表達(dá)，也可考慮用反義RNA技術(shù)來(lái)控制rol基因在特定器官和組織中的表達(dá)。K.V.KISELEV,O.V.GRISHCHENKO,Y.N.ZHURAVLEV.2010.CDPKgeneexpressioninsalttolerantrolBandrolCtransformedcellculturesofPanaxginseng.BIOLOGIAPLANTARUM54(4):621-630KonstantinV.Kiselev,AnnaV,Turlenko,Yuri,.2009.CDPKgeneexpressioninsomaticembryosofPanaxginsengexpressingrolCPlantCellTissOrganCult.99:141149VictorP.Bulgakov,TatianaY.Gorpenchenkoetal.,.2012.TherolBGeneSuppressesReactiveOxygenSpeciesinTransformedPlantCellsthroughtheSustainedActivationofAntioxidantDefense.PlantPhysiology,158:1371138