免疫熒光方法

1、免疫熒光（mmn）實(shí)驗(yàn)方法免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻

2、片（i）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如或n中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在C或C避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無(wú)法像那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一

3、個(gè)完美的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照?？傊庖邿晒鈱?shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。基本?shí)驗(yàn)步驟：（1）細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用離心洗滌（m次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。（）固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的中C保存3個(gè)月。洗

4、滌3X5min.（3）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在55mi通透后用洗滌3X5min.（）封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為3min.（5）一抗結(jié)合。室溫孵育或者C過(guò)夜。漂洗3次，每次沖洗5min.（）二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。（7）封片及檢測(cè)。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。（一）細(xì)胞準(zhǔn)備用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長(zhǎng)在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過(guò)離心后涂片的

5、懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時(shí)直接放入讓細(xì)胞生長(zhǎng)在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實(shí)驗(yàn)需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。（二）固定和通透除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的目的有三：防止細(xì)胞從玻片上脫落；除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂；使標(biāo)本易于保存。標(biāo)本的固定原則是：不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；不能凝集蛋白質(zhì)；應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進(jìn)入所有細(xì)胞與亞細(xì)胞組分與抗原結(jié)合。常

6、用的固定劑有多種，應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌Ｍǔ９潭ǚ椒梢苑譃閮深悾河袡C(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過(guò)自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但因?yàn)榻宦?lián)阻礙抗體結(jié)合，可能會(huì)降低一些細(xì)胞組分的抗原性，因此需要增加一個(gè)通透步驟以使抗體能夠進(jìn)入標(biāo)本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進(jìn)行固定。通常，細(xì)胞

7、結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進(jìn)行通透以使抗體能達(dá)到抗原表位。通透步驟只在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要，因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測(cè)蛋白。但是，如果待檢測(cè)的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透。相反，如果所檢測(cè)的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時(shí)是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場(chǎng)合并不適合用甲醇，因?yàn)橐恍┍砦粚?duì)甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如以及和等。

8、和屬于烈性去垢劑，可部分溶解細(xì)胞核膜，因此非常適合核抗原檢測(cè)。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，它們將破壞蛋白，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。是最常用的通透劑，但是它將破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過(guò)，但是不會(huì)溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對(duì)有些水不溶性的目的抗原的檢測(cè)宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過(guò)通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號(hào)。固定后以冷液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性

9、熒光。（三）封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為其他可選擇的封閉劑還有或與二抗種屬相同的血清（）等。（四）抗體孵育直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時(shí)候必須注意避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)行。（五）封片及熒光觀察標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察，特別是有時(shí)候封片不當(dāng)反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，以便進(jìn)一步觀察、照像、統(tǒng)計(jì)分析等，需作封片處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強(qiáng)封片的效果，往往需要在封片時(shí)添加特殊的抗熒光淬滅劑。（六）標(biāo)本保存由于熒光色素

10、和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因此隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來(lái)一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn)，熒光標(biāo)記的標(biāo)本可以在低溫（C或C）下保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。在某些情形下，考慮到實(shí)驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件，也可以采取權(quán)宜的辦法，比如固定標(biāo)本片后低溫保存，在需要時(shí)再進(jìn)行熒光標(biāo)記，即隨用隨染。直接免疫熒光法測(cè)抗原基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體此法常用于細(xì)菌

11、、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器TOC o 1-5 h z磷酸鹽緩沖鹽水（）：，的進(jìn)行稀釋碳酸鹽緩沖液份配制）熒光標(biāo)記的抗體溶液：以，緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油9份+p搪瓷桶三只（內(nèi)有，的有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）熒光顯微鏡玻片架濾紙HC溫箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1滴加，的于待檢標(biāo)本片上，后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。、滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：）i、取出玻片，置玻片架上，先用，的沖洗后，再按順序過(guò)，的三缸浸泡，每缸，不時(shí)振蕩。、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，

12、以蓋玻片覆5、立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無(wú)熒光；（）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+-+）+熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”以上，而各種對(duì)照顯示為（）或（-），即可判定為陽(yáng)性。注意事項(xiàng)1、對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1：0，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。、染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從到數(shù)小時(shí)，一般已足夠。染色溫度多采用室溫（C左右），高于C可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用

13、0-、的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較7效果好的多。3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。()標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加滴，的。()特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn))：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。(3)陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。4一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。免疫熒光染色(間接法)1、切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血

14、清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，C作用，然后用洗兩次，用吸水吸去或吹干余留的液體。2再滴加間接熒光抗體(如兔抗人球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色，C,緩沖鹽水洗兩次，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。對(duì)照染色：抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性?？乖瓕?duì)照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。陽(yáng)性對(duì)照。間接法中上述方法稱雙層法()e另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上,而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下：切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于7，。

15、緩沖鹽水洗次，每次，吹干。滴加特異性熒光抗體再用切片于7，。如水洗。緩沖甘油封固，鏡檢。易生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)頻道生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)資料庫(kù)！細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)間接免疫熒光法細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)過(guò)程與細(xì)胞表面抗原檢測(cè)過(guò)程基本一致，只是在與一抗孵育前,需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞用非離子去污劑進(jìn)行透化處理。【操作方法】(1)取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組織切片(石蠟或冰凍切片)；()用含或的溶液透化固定后的細(xì)胞(室溫)，有些標(biāo)本可能需要長(zhǎng)達(dá)，時(shí)間視抗原而定；(3)余下步驟接上述“細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)-間接免疫熒光法”步驟(2)；【注意事項(xiàng)】(1)在使用前，一抗二抗均應(yīng)測(cè)試其合適的稀釋度。（2）多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)

16、本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。（3）信號(hào)微弱的解決方法：提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性，這必須測(cè)試各種濃度抗體的滴度；延長(zhǎng)一抗和二抗的孵育時(shí)間。由于細(xì)胞染色時(shí)抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時(shí)間較在溶液中長(zhǎng)。孵育時(shí)間可因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)作適當(dāng)調(diào)整，但少于0抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點(diǎn)中，應(yīng)摸索出一個(gè)最佳條件以產(chǎn)生有效信號(hào)且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗(yàn)，因?yàn)槊拷M抗體和抗原的情況會(huì)有所不同；改變檢測(cè)方法，用共聚焦顯微鏡觀察，可提高敏感性。（4）背景不好的解決方法細(xì)胞樣本進(jìn)行熒光染色時(shí)，背景問(wèn)題主要來(lái)自兩個(gè)方面，即非特異性染色和特異性交叉反應(yīng)。非特異性吸附：非特異性吸附背景問(wèn)題的產(chǎn)生與抗原抗體的特異性結(jié)合無(wú)關(guān)。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附，而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。將所有抗體溶液或含蛋白的檢測(cè)試劑用00000g離心0以去除蛋白聚合物。滴定*一抗和所用的檢測(cè)試劑，以確定能夠產(chǎn)生合適信號(hào)的最低濃度。固定*后，用飽和量并不被檢測(cè)試劑結(jié)合的非特異性抗體封閉樣品，有效的封閉液包括的