豬鏈球菌的分離鑒定

1、目 錄中文摘要1英文摘要2前言 31.材料與方法41.1 實(shí)驗(yàn)材料41.1.1 病料41.1.2 儀器41.1.3 試劑及藥品51.1.4 培養(yǎng)基的制備51.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物61.2 試驗(yàn)方法61.2.1 細(xì)菌涂片、染色、鏡檢61.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)61.2.3 生化試驗(yàn)61.2.4 血清學(xué)鑒定71.2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)71.2.6 藥敏試驗(yàn)82 結(jié)果與分析82.1 染色結(jié)果82.2 分離培養(yǎng)結(jié)果92.3 生化試驗(yàn)結(jié)果92.4 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果102.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果102.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果102.7 防治103.結(jié)論與討論113.1 關(guān)于豬鏈球菌致病機(jī)理113.2 關(guān)于豬鏈球菌病診斷

2、123.3 關(guān)于豬鏈球菌病防制133.4 結(jié) 論14參考文獻(xiàn)15致謝16摘 要豬鏈球菌病是豬鏈球菌（Streptococcosis suis）引起的豬的一種重要的疾病，豬只不分品種和年齡階段均容易感染，并且能夠感染給人，可導(dǎo)致人和豬的死亡。豬鏈球菌主要感染3-12周齡的仔豬。近些年來，在美國(guó)、英國(guó)、荷蘭、日本、加拿大、丹麥等許多國(guó)家均有豬鏈球菌病發(fā)生的報(bào)道，并在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)南方幾省也曾經(jīng)一度廣泛流行，給我國(guó)也帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前已經(jīng)鑒定出了35種血清型的豬鏈球菌，其中以2型最重要、最為常見。2004年4月，沈陽(yáng)市某種豬繁育場(chǎng)大范圍的發(fā)生仔豬的關(guān)節(jié)炎和敗血癥。本次

3、試驗(yàn)以無(wú)菌采取患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)各8份作為病料，并對(duì)這16份病料進(jìn)行了病原菌分離試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定、藥敏試驗(yàn)、致病力試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，而且引起關(guān)節(jié)炎癥狀的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對(duì)頭孢菌素、青霉素等高度敏感，而對(duì)土霉素、鏈霉素等具有較強(qiáng)的耐藥性。關(guān)鍵詞：豬；鏈球菌；分離鑒定 AbsractStreptococcosis suis disease is an important disease of pigs ,witch is caused by Streptococcosis suis.All breeds a

4、nd ages are susceptible. It can infect people and may lead to the death of people or pigs. Streptococcosis suis infect piglets of the ages witch is from 3 weeks to 12 weeks usually.In the recent years ,the disease has been reported occuring in many countries such as American,England,Japan,Holand,Can

5、ada and Danmark ect. And it caused a lot of economic losses in all over the world.In some provinces in south of China the disease spread widely and caused a lot of losses too.By now 35 kinds of serum types have been appraised and the 2 serum type is most important and most common.In Shenyang the art

6、hritis and blood pionsioning occurred in piglets widely in some hogger in May 4th,2004.As the pathological material of disease we took eight shares each of the liquid of arthrotis from the piglets sickening arthritis and liver,lungs,spleen,mesentery lymth nodes shares,and on these sixteen shares the

7、 separation experiment,the appraisal to serology ,the agile experiment of medicine and the capacity of causing disease were carried on. The result makes it known :it is the 2 serum type causing to the disease and it is lower capacity of causing to the arthritis than that of the blood poisioning; Str

8、eptococcosis suis is highly sentitive to Cephalosporin and Penicillin, but the medicine enduring of witch is greater to some such as Terramycin and Streptomycin.Keywords: Pig；Streptococcus；Separation and Identification前言豬鏈球菌（Streptococcosis suis）在1956年1963年間Demoor，首次通過生化和血清學(xué)方法，對(duì)豬的敗血性感染的新的a溶血性鏈球菌進(jìn)行了鑒

9、定，它屬于蘭氏R、S、RS和T群在英國(guó)Elliott(1966)建議Demoor的S群與純化的PM鏈球菌相似，兩者都?xì)w屬于蘭氏D群，他命名該鏈球菌相似，兩者都?xì)w屬于蘭氏D群，他命名為豬鏈球菌莢膜2型，1型與仔豬腦膜炎有關(guān)，而2型菌株可感染任何日齡的豬，與1型和2型抗血清均有反應(yīng)的菌株為莢膜1/2，1983年1995年描述了35個(gè)菌株，共分成32個(gè)新的莢型，莢膜2型菌株，在所在國(guó)家發(fā)病豬中都是主導(dǎo)菌株，某些不常見的莢膜型的菌株，可以引起嚴(yán)重感染，如9型與斷奶仔豬的敗血癥腦膜炎，肺炎暴發(fā)有關(guān)。 豬鏈球菌病是豬的一種重要疾病，養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家如美、英、荷及愛爾蘭等常有本病發(fā)生。我國(guó)于1958年就有豬鏈

10、球菌病的報(bào)道，1976年我國(guó)南方幾省曾一度廣泛流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大危害。豬鏈球菌截止到目前已發(fā)現(xiàn)的莢膜型已超過30多種,其中以2型最重要、最為常見1。我國(guó)于1995年首例鑒定證實(shí)2型豬鏈球菌在我國(guó)的存在 2。豬鏈球菌可致26周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及支氣管肺炎等37。本病在豬群暴發(fā)流行時(shí),與豬經(jīng)常接觸的牛犬和禽類不見發(fā)病.在豬中仔豬,架子豬和懷孕母豬的發(fā)病率高。人工感染家兔最敏感,次為倉(cāng)鼠,小鼠,鴿和雞。病原 鏈球菌系鏈球菌科(Streptococcaceae)鏈球菌屬(Streptcoccus)的細(xì)菌,種類繁多,在自然界中分布很廣,是一種呈球狀細(xì)菌,沿一個(gè)方向進(jìn)行分裂繁殖,因而

11、呈菌數(shù)不等和長(zhǎng)短不一的鏈狀排列。不形成芽胞,有的在病料中或含血清的培養(yǎng)基內(nèi)能形成莢膜,為革蘭氏陽(yáng)性菌,一般為兼性厭氧菌5。該菌在糞便、灰塵和死尸中存活很長(zhǎng)時(shí)間,但對(duì)去污劑和普通消毒劑敏感6。此菌抵抗力不強(qiáng), 對(duì)干燥、濕熱敏感,6030min即可被殺死。按Lancefield血清學(xué)分群方法,鏈球菌分為20個(gè)菌群,與其有關(guān)的血清群是A、B、C、D、E(P.U.V)、Q、G、L、N、M、P、R(D)、S(D)14個(gè)菌群,目前,A、B、C、D、E、L等6個(gè)是引起發(fā)病的主要菌群5。根據(jù)鏈球菌菌體莢膜抗原特性的不同,D群又分成35個(gè)血清型,即134型和1/2型,其中以2型流行最廣,對(duì)豬的致死性亦最強(qiáng),其次

12、是1型,其他有致病性的35,79和11,1/2型等3。國(guó)外多由D群的某些血清型特別是2型引起豬的敗血型和腦炎型鏈球菌病,而在國(guó)內(nèi)以C群的獸疫鏈球菌為主,D群較少,E群則引起慢性鏈球菌的關(guān)節(jié)炎和淋巴結(jié)炎(膿腫)。一般的豬場(chǎng)都有23個(gè)致病菌混合感染,1頭豬可以同時(shí)感染23個(gè)菌群78。診斷 根據(jù)臨床癥狀，年齡和肉眼病理變化及鏡檢即可確診。特征性臨床癥狀有磨牙、跛行、排干糞、空嚼，淋巴結(jié)腫大，皮膚、耳、四肢末稍有出血斑。肉眼可見急性死豬全身皮膚淤血，呈暗紫色，肺充血，肺廣泛散在小葉性肺炎，心包積液，心內(nèi)膜出血，關(guān)節(jié)內(nèi)有膠樣的液體或纖維素性、膿性分泌物，淋巴結(jié)膿腫出血，心二尖瓣有菜花狀增生物。結(jié)合涂片、

13、染色、鏡檢，分離培養(yǎng)，生化試驗(yàn)，動(dòng)物接種等細(xì)菌學(xué)檢查即可確診鏈球菌病。防制 首先嚴(yán)格檢疫不從疫區(qū)購(gòu)入病豬和帶菌豬,對(duì)病豬隔離,病死豬無(wú)害化處理,深埋1。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意環(huán)境衛(wèi)生和經(jīng)常性可能污染的環(huán)境、用具消毒。為根除本病在豬群中發(fā)生最好淘汰病豬。其次可用預(yù)防接種防治此病目前國(guó)產(chǎn)的疫苗主要有豬鏈球菌多價(jià)滅活苗、氫氧化鋁甲醛苗、弱毒凍干苗,按瓶簽說明使用,免疫期6個(gè)月,可達(dá)到預(yù)期效果。再者對(duì)患病豬群要作到及時(shí)發(fā)現(xiàn),盡早治療,可通過藥敏試驗(yàn)，確定高效藥物，連續(xù)用藥,加強(qiáng)鞏固療效是治療本病的關(guān)鍵。 2004年4月，沈陽(yáng)市某種豬繁育場(chǎng)仔豬，多為26周齡仔豬。出現(xiàn)體溫時(shí)高時(shí)低,精神食欲時(shí)好時(shí)壞,一肢或多

14、肢關(guān)節(jié)腫大,跛行或不能站應(yīng),消瘦,衰弱或突然惡化而死亡等癥狀。病死豬和放血致死豬均呈衰竭狀，后肢皮下有淡灰色膠凍樣滲出物，腹股溝、掖下淋巴結(jié)腫大，多數(shù)關(guān)節(jié)部肌肉組織化膿，膿腫局限于單塊肌肉中，切開后內(nèi)容物有的就較干燥，有的呈半流體狀，均呈淡黃色，膿腫周圍有包膜，與周圍健康組織界限明確，無(wú)粘連；膿腫內(nèi)容物均呈半流體或豆腐渣樣。肝脾包膜稍厚無(wú)明顯壞死灶，腸系膜淋巴結(jié)腫大，質(zhì)度堅(jiān)實(shí)，表面及切面呈黃白色。小腸及結(jié)腸的漿膜有個(gè)別小出血點(diǎn)，小腸粘膜有輕微滲出性。肺臟心葉和間葉出現(xiàn)融合，小葉性肺炎，關(guān)節(jié)和皮下膿腫。疑為豬鏈球菌病，為作進(jìn)一步診斷，無(wú)菌采取關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴

15、結(jié)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，證實(shí)為2型豬鏈球菌?，F(xiàn)將分離鑒定結(jié)果報(bào)告如下。材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1 病料 無(wú)菌采取患關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液8份，編號(hào)為18號(hào)，無(wú)菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)8份，編號(hào)為916號(hào)。1.1.2 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 型號(hào) HG303-3K 南京電器三廠制造電熱鼓風(fēng)干燥箱 型號(hào) HG101-1 南京電器三廠制造電熱手提高壓蒸汽消毒器YXQ.SG41.280上海醫(yī)用核子儀器廠顯微鏡雙筒 型號(hào) JENAAnke TDL80-2B 離心機(jī) 上海浦江科學(xué)儀器廠1.1.3 試劑及藥品 40KOH；肌酐（Creatine）蛋白胨瓊脂；氯化鈉膽鹽；葡萄糖；KH2PO4

16、 ；0.2酚紅；0.2溴麝香草酚藍(lán)；純乙醇；濃鹽酸；硫代硫酸鈉；醋酸鉛微量糖發(fā)酵管（上海化學(xué)試劑二廠）分別為：蔗糖；山梨醇；棉實(shí)糖；葡萄糖；甘露糖；蕈糖；乳糖；菊糖；水楊苷；馬尿酸鈉藥敏紙片（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)）分別為：頭孢菌素；慶大霉素；潔霉素；青霉素；卡那霉素；鏈霉素；土霉素；復(fù)方新諾明；萬(wàn)古霉素；紅霉素；利福平；氯霉素；恩諾沙星；痢特靈豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原（中國(guó)獸藥鑒察所）1.1.4 培養(yǎng)基的制備 兔鮮血平板：將滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，冷至4550時(shí)，加入無(wú)菌鮮血達(dá)5%（即每100毫升營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入鮮血56毫升）傾注于平皿，待凝固后，置37培養(yǎng)12日，有污染者廢棄，無(wú)

17、菌者保存于冰箱備用。牛血清肉湯：向滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中加入牛血清，每100毫升加20毫升牛血清，分裝試管，置37培養(yǎng)12日，有污染者廢棄，無(wú)菌者保存于冰箱備用。麥康凱培養(yǎng)基：取成品50克加入1000毫升冷蒸餾水，混合放置20分鐘，隔石棉鐵絲網(wǎng)微火煮沸至全部溶解，高壓滅菌（115）15分鐘后冷卻至50左右，傾入無(wú)菌平皿內(nèi)，凝固后冷藏備用。營(yíng)養(yǎng)瓊脂： 取成品41克加入1000毫升冷蒸餾水混合放置20分鐘，隔石棉鐵絲網(wǎng)微火煮沸，至全部溶解，分裝入適當(dāng)容器中高壓滅菌（121）15分鐘，凝固后冷藏備用。Christenrsen氏培養(yǎng)基：1升含蛋白胨1克，葡萄糖1克，氯化鈉5克，KH2PO4 2克0.2酚紅溶

18、液6ml，瓊脂20克，調(diào)整pH至6.9。在121高壓滅菌15分鐘，使冷到55時(shí)加入十分之一的20尿素液（經(jīng)濾過法除菌的）使尿素含量為2（即每1000ml中有20克），做成短斜面。鄧亨氏蛋白胨溶液：蛋白胨水溶液（蛋白胨1克，氯化鈉0.5克，水100ml,pH7.6）按0.51的比例加入葡萄糖（或其他各種糖），每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚藍(lán)（或用1.6溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示劑。分裝于試管（每一個(gè)試管事先加有一枚倒立的小發(fā)酵管），10磅高壓滅菌10分鐘。甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5克，完全溶解于1000ml水中后，分裝試管內(nèi)，間歇滅菌或10磅10

19、分鐘滅菌。歐立希氏吲哚試劑： 對(duì)位二甲基苯甲醛1克，純乙醇95ml，濃鹽酸25ml,先以乙醇溶液試劑后加鹽酸，要避光保存21。1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 健康小白鼠（3035g）10只，購(gòu)自沈陽(yáng)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 染色鏡檢將所采病料分別涂片，用革蘭氏染色鏡檢抹片的制備及染色：先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用滅菌接種環(huán)取少量菌落在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。讓其然干燥。固定用火焰固定法。將干燥好的抹片使涂面向上，以其背面在灑精燈火焰上來回通過數(shù)次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手為度）進(jìn)行固定。染色用革蘭氏染色法。革蘭氏染色法：在已干燥

20、、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1-2分鐘，水洗。加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分鐘，水洗。加95%酒精于抹片上脫色，約30秒至1分鐘，水洗。加稀釋石炭酸復(fù)紅（或沙黃水溶液）復(fù)染10-30秒鐘，水洗。吸干或自然干燥，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)色，革蘭氏陰性菌呈紅色。1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)將所采病料，分別接種鮮血瓊脂平板，麥康凱平板，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。37需氧培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于改良馬丁肉湯，37培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4，冷藏備用。1.2.3生化試驗(yàn)隨機(jī)抽取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物3#、8#、13#、15#，分別作以下生化試驗(yàn)。

21、糖發(fā)酵試驗(yàn)：用滅菌接種針將待檢菌分別接種于微量糖發(fā)酵管中（分別為蔗糖 山梨醇 棉實(shí)糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水楊苷 馬尿酸鈉），然后將其倒置于燒杯中，在恒溫箱中37培養(yǎng)，24小后觀察。凡發(fā)酵管中有變色者表示此菌產(chǎn)酸，凡培養(yǎng)基變色并產(chǎn)氣者為此糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，凡培養(yǎng)基不變色者表示該菌不發(fā)酵此糖。維培（V-P）二氏試驗(yàn)：原理：某些細(xì)菌能從葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（Acetyethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol）,在有堿存在時(shí)氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，產(chǎn)生粉紅色的化合物。方法：（OMearaas試劑法） 40KOH 5ml

22、、肌酐1小刀尖加入于5ml（即與培養(yǎng)基等量）的培養(yǎng)物中，猛烈搖振混合。37培養(yǎng)2448小時(shí)，加數(shù)滴試劑，略加搖勻半分鐘，待試劑上浮液面，試劑呈紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)： 方法：用接種針將待試菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中。37卵育14天，每天檢查，沿穿刺線或其周圍變?yōu)楹谏珵殛?yáng)性反應(yīng)。甲基紅（M.R）試驗(yàn)： 方法：接種細(xì)菌于培養(yǎng)液中，在37培養(yǎng)27天后。于培養(yǎng)物中加入幾滴試劑，變紅者為陽(yáng)性反應(yīng)，（從葡萄糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)液的pH低于4.2）。吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)： 原理：細(xì)菌能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚，后者與對(duì)位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。 方法：以接種環(huán)接種待檢細(xì)

23、菌的新鮮斜面培養(yǎng)物于鄧亨氏蛋白胨溶液中，在37培養(yǎng)2448小時(shí)（可延長(zhǎng)45天）。于培養(yǎng)液中加入戊醇或二甲苯23ml,搖勻，靜置片刻后，沿試管壁加入試劑2ml。在戊醇或甲苯下面的液體變紅色者為陽(yáng)性反應(yīng)。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)： 方法：用滅菌的接種針蘸取待檢液，在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上劃線接種，再穿刺接種。在37培養(yǎng)23天，觀察培養(yǎng)基上是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，并觀察顏色變化。如果有細(xì)菌生長(zhǎng)，并且顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，則為陽(yáng)性反應(yīng)，說明此菌能利用枸櫞酸鹽。硫化氫試驗(yàn)： 原理：細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫（H2S）者，其所產(chǎn)生的H2S會(huì)使培養(yǎng)基中的醋酸鉛或FeCl3形成黑色的硫化氫或硫化鐵。 方法：在融化的瓊脂內(nèi)加入

24、硫代硫酸鈉溶液（先煮沸滅菌），待涼至60，再加入醋酸鉛溶液，混合均勻，無(wú)菌分裝滅菌試管達(dá)三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成瓊脂高層。用接種針蘸取純培養(yǎng)物，沿試管壁作穿刺，孵育于37經(jīng)天后觀察，必要可延長(zhǎng)天。培養(yǎng)基變?yōu)楹谡邽殛?yáng)性6。1.2.4血清學(xué)鑒定 將3#、8#、13#、15#菌經(jīng)緩沖肉湯培養(yǎng)8h，通過3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用pH7.2 的0.01mol/L PBS制成1/100001/20000細(xì)菌懸液11。取1滴上述細(xì)菌懸液與適當(dāng)?shù)目寡逶跐崈舨Ｆ匣靹颍⒓从^察凝集現(xiàn)象。同時(shí)，設(shè)立細(xì)菌懸液對(duì)照及血清對(duì)照。1.2.5動(dòng)物致病性試驗(yàn)小白鼠感染實(shí)驗(yàn)：用5只20克左右

25、重的小白鼠腹腔接種分離菌血清肉湯培養(yǎng)物0.2毫升，另設(shè)5只分別腹腔注射0.2毫升血清肉湯作對(duì)照。對(duì)注射后的小白鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況，對(duì)死亡的小白鼠立即解剖，無(wú)菌采取肝臟，脾臟病料，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。并在鮮血瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)12。1.2.6藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無(wú)菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，42h使藥物擴(kuò)散，然后置37培養(yǎng)2024h，觀察結(jié)果。結(jié)果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)定為高度敏感、中度敏感或耐藥13。結(jié)果評(píng)定參照表1。表 1 各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標(biāo)準(zhǔn)抗菌

26、藥物名稱抑菌圈直徑（mm）耐藥中度敏感高度敏感 青霉素 土霉素 潔霉素 鏈霉素慶大霉素卡那霉素頭孢菌素萬(wàn)古霉素紅霉素利福平呋喃妥因氟哌酸 復(fù)合磺胺氯霉素1010101012121010141615131113151515151515122220171716182 結(jié)果與分析2.1涂片、染色、鏡檢結(jié)果 關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂、改良馬丁肉湯及血清肉湯培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽(yáng)性，在關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂培養(yǎng)物中多呈單個(gè)、雙球或短鏈狀排列，在改良馬丁肉湯及血清肉湯培養(yǎng)物中多呈長(zhǎng)鏈狀。2.2分離培養(yǎng)結(jié)果 37培養(yǎng)24h后，所采的16份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明

27、顯的溶血環(huán)。在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)不好。該菌在改良馬丁肉湯中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。2.3生化試驗(yàn)結(jié)果（見表2、表3）表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果菌號(hào) 項(xiàng) 目蔗糖 山梨醇 棉實(shí)糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水楊苷 馬尿酸鈉3# + - - + + + + + + -8# + - - + + + + + + -13# + - - + + + + + -15# + - - + + + + + + -表3 其它生化試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目 菌 號(hào)3# 8# 13# 15# 維培（V-P）二氏試驗(yàn) - - - -靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn) - -

28、 - - 甲基紅（M.R）試驗(yàn) - - - -枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) - - - -硫化氫試驗(yàn) - - - - 判定標(biāo)準(zhǔn)：“+”表示大多數(shù)（90%100%）菌株為陽(yáng)性；“-”表示大多數(shù)（90%100%）菌株為陰性。表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果將3#、8#、13#、15#細(xì)菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現(xiàn)象，但不與1型及其他型抗血清出現(xiàn)凝集。直接挑取細(xì)菌菌落與血清混勻，也能得到一致結(jié)果。陰性對(duì)照均未見凝集現(xiàn)象。2.5動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果分離菌對(duì)小白鼠致病性：小白鼠于感染后5小時(shí)開始死

29、亡，至24小時(shí)全部死亡。死亡后解剖小數(shù)可見肝、脾、腎腫大，膀胱高度充血，胸腔集液，用心血及胸腔積液涂片，革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量單個(gè)、成對(duì)或4-20個(gè)左右的短鏈革蘭氏陽(yáng)性球菌。對(duì)照組小白鼠未見異常。2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表4、表5）表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果菌號(hào)抑菌環(huán)直徑（mm）頭孢菌素青霉素潔霉素卡那霉素土霉素鏈霉素慶大霉素 3# 8#13#15#平均值1918191918.751516161515.51413141313.51313131413.2588787.7576787.077887.5 表5藥敏試驗(yàn)結(jié)果菌號(hào)抑菌環(huán)直徑（mm）萬(wàn)古霉素利福平紅霉素復(fù)合磺胺氟哌酸氯霉素恩諾沙星 3# 8#13

30、#15#平均值1010.5111010.3797877.751413141313.51615161716.088787.751516161716.02120202020.25表3表明，結(jié)果敏感的藥物是：頭孢菌素、青霉素、恩諾沙星；中度敏感的是：復(fù)合磺胺、氯霉素、紅霉素、潔霉素和卡那霉素；而對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、氟哌酸、土霉素、鏈霉素、慶大霉素不敏感。2.7 防治通過上述試驗(yàn)結(jié)果確定該種豬繁育場(chǎng)發(fā)生的豬鏈球菌病為豬鏈球菌2型所引起，對(duì)頭孢菌素、青霉素、恩諾沙星高度敏感，考慮到經(jīng)濟(jì)因素選用用青霉素30004000單位公斤體重，每日4次，肌肉注射，連續(xù)注射35日病豬病情得到好轉(zhuǎn)。同時(shí)對(duì)所有的未發(fā)病仔豬

31、用滅活疫苗免疫接種，并將病豬和健康豬隔離。另外，注意衛(wèi)生管理，對(duì)圈舍、廠區(qū)、各種用具進(jìn)行消毒。目前該病已得到有效的控制。3 結(jié)論與討論3.1關(guān)于豬鏈球菌致病機(jī)理豬鏈球菌（Streptoccus suts）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開始增加。那時(shí)僅檢出9種夾膜血清型，到目前為止已經(jīng)鑒定出了35種血清型的豬鏈球菌，其中2型是最常見的1。我國(guó)于1991年在廣東省首次證實(shí)此菌存在2，1998年在江蘇的人群和豬群中爆發(fā)由2型所致的鏈球菌病14。毒力因子及其致病機(jī)理是豬鏈球菌病防治的理論基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外均已對(duì)豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白進(jìn)行過大量研究15，16。發(fā)現(xiàn)豬鏈

32、球菌2型溶菌酶釋放的蛋白具有誘導(dǎo)上皮細(xì)胞融合和凋亡功能，此作用可使本來致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，從而使上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)失去其屏障，是豬鏈球菌2型感染過程中突破扁桃體和大腦血腦屏障的關(guān)鍵機(jī)制之一。血腦屏障有兩條主要通路：血-腦通路由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，血-腦脊液屏障由脈絡(luò)從上皮細(xì)胞構(gòu)成。通過曾巧英等人的試驗(yàn)結(jié)果推斷，脈絡(luò)叢應(yīng)該是豬鏈球菌2型致腦膜炎時(shí)突破大腦屏障的通路之一。有報(bào)道豬鏈球菌2型致腦膜炎時(shí)，大腦實(shí)質(zhì)并沒有發(fā)現(xiàn)有病變，而無(wú)論是自然感染還是試驗(yàn)感染豬，經(jīng)長(zhǎng)期的菌血癥后，均有脈絡(luò)叢刷狀緣的細(xì)胞損傷，腦室中也有纖維素和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)17。豬鏈球菌2型溶血素是一種溶細(xì)胞性蛋白質(zhì)毒素,其溶血活性受溫度、p

33、H值等的影響,具有酶的典型特征。試驗(yàn)用酶學(xué)試驗(yàn)方法,對(duì)其側(cè)鏈氨基酸基團(tuán)進(jìn)行了化學(xué)修飾,探明其活性基團(tuán),尚未見報(bào)道。盡管豬鏈球菌2型的溶血素可被巰基等還原劑活化,但本試驗(yàn)顯示,PCBM等對(duì)該溶血素的溶血活性均無(wú)抑制作用,表明巰基等不是該溶血素活性必需基團(tuán)。豬鏈球菌2型溶血素經(jīng)NBS、DEPC和2,3 iacetyl修飾后,其溶血活性顯著降低,表明色氨酸、組氨酸和精氨酸殘基才是該溶血素的活性必需基團(tuán)。二硫鍵的斷裂,使其疏水基團(tuán)充分暴露,有利于溶血素與細(xì)胞膜相結(jié)合。作者推測(cè)豬鏈球菌2型溶血素可能是一種磷脂酶,能水解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙分子層,進(jìn)而達(dá)到溶血的功能。強(qiáng)烈地抑制了豬鏈球菌2型溶血素的溶血活性,

34、其原因是在酸性條件下(4 0),選擇性氧化色氨酸殘基側(cè)鏈吲哚為氧化吲哚,而使其喪失活性,另外,還可能引起肽鍵斷裂,導(dǎo)致溶血活性的喪失。通過 ,結(jié)果為一條帶,因此可排除因肽鍵斷裂而引起溶血活性降低的可能性。這一點(diǎn)與嗜水氣單胞菌的胞外蛋白酶的修飾相一致4。通過9種蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基修飾劑對(duì)豬鏈球菌2型溶血素進(jìn)行化學(xué)修飾,初步確定了色氨酸、組氨酸、精氨酸殘基及二硫鍵與其溶血活性相關(guān),但究竟哪個(gè)基團(tuán)或哪些基團(tuán)參與了溶血作用,或哪些基團(tuán)參與了其結(jié)合作用,還需進(jìn)一步深入研究18。3.2關(guān)于豬鏈球菌病的診斷豬鏈球菌病在獸醫(yī)臨床上可通過臨床癥狀、剖檢癥狀來進(jìn)行診斷。3.2.1臨床癥狀最急性型：無(wú)任何前驅(qū)癥狀,突然

35、發(fā)病后于次日早晨死亡,或倒地不起,口鼻流白沫。觸摸時(shí)驚叫,全身皮膚藍(lán)紫色, 體溫42以上,多在1218h死亡。急性敗血型：此型主要由C、D、L鏈球菌引起,常為暴發(fā)流行。突然發(fā)生,全身癥狀明顯,精神沉郁,食欲不振或廢絕,體溫40.543,多集中在41.341.6間,稽留熱,眼結(jié)膜潮紅,有淚跡,鼻盤微紅但仍濕潤(rùn),流鼻液或漿液性鼻漏,有的從口角流出少量黏液;便秘、糞干硬,有的表面上附有黏膜;尿黃或赤褐色。兩耳、鼻腔、頸、背部、整個(gè)下腹皮膚、四肢內(nèi)側(cè)呈廣泛性充血、潮紅或紫斑;數(shù)小時(shí)內(nèi)可見后驅(qū)軟弱,兩后肢交叉或并在一起支撐,難以站立,甚至后軀麻痹,四腳運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào),運(yùn)步強(qiáng)拘跛行、后期有的呈犬坐姿勢(shì),呼吸短

36、促或困難,可聽到喘息聲,人為驅(qū)趕或觸診尖叫,有的出現(xiàn)抽搐、空嚼或昏睡等神經(jīng)癥狀。病程經(jīng)過急,治療不及時(shí),23d內(nèi)死亡,死前天然孔流出暗紅色血液,病死率達(dá)80%90%。腦膜腦炎型：主要由R、C群引起,但L、S群等也可引起發(fā)病。常見于仔豬因斷乳、去勢(shì)、轉(zhuǎn)群、氣候驟變等誘發(fā)。體溫40.542.5,不食、便秘、震顫,有漿液性或粘性鼻漏。病豬表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀,如角弓反張、抽搐、共濟(jì)失調(diào)、失明、耳聾。繼而后肢麻痹,前肢爬行,四肢作游泳狀或昏迷不醒等。個(gè)別病豬出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)腫大,跗關(guān)節(jié)外側(cè)及上、下方見13個(gè)鴿蛋大小腫脹。最急性者幾小時(shí)或12d內(nèi)死亡。病程達(dá)35d者,有部分豬的頭、頸、背等部位出現(xiàn)水腫,

37、指壓凹陷。亞急性或慢性：由上述2、3兩型因治療不及時(shí)或藥效不足轉(zhuǎn)化而來或在流行的中、后期也會(huì)出現(xiàn)亞急性或慢性病例。主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎,心內(nèi)膜炎、化膿性淋巴結(jié)炎、膿腫、子宮炎(流產(chǎn))、包皮炎、乳房炎、咽喉炎及皮炎等。呈散發(fā)性或地方流行性,其特點(diǎn)是病程長(zhǎng)(十幾天至一個(gè)多月),癥狀比較緩和。關(guān)節(jié)及心內(nèi)膜炎：病豬體溫時(shí)高時(shí)低,精神食欲時(shí)好時(shí)壞或吃半飽,一肢或多肢關(guān)節(jié)腫大,跛行或不能站應(yīng),逐步消瘦,衰弱或突然惡化而死亡,或逐漸好轉(zhuǎn)而恢復(fù)?；撔粤馨徒Y(jié)炎：以頜下淋巴結(jié)化膿性炎癥為最常見,咽、耳下、頸部等淋巴結(jié)發(fā)炎腫脹、硬、熱、痛,皮膚壞死。由于局部的壓迫或疼痛,可影響采食、咀嚼、吞咽,甚至使呼吸產(chǎn)生障礙。當(dāng)

38、化膿成熟,破潰之后流出膿汁,全身癥狀也顯著好轉(zhuǎn),長(zhǎng)出肉芽組織,結(jié)疤愈合,病程35個(gè)星期,一般不引起死亡。3.2.2剖檢癥狀最急性型：主要病變是腦膜明顯充血,腦室不同程度的積水;心包積液增多,淋巴結(jié)腫大,充血,血凝固不良,其他臟器無(wú)明顯變化。急性敗血型：以出血性敗血癥病變和漿膜炎為主,血凝不良,皮膚有紫斑,黏膜,漿膜下出血。漿膜腔積液含有纖維素。鼻腔有黏液和泡沫,鼻黏膜紫紅色、充血及出血。喉頭、氣管充血,常見大量泡沫。肺充血腫脹,切面出血,有的肺表面有散在淤血斑。心包增厚,表面粗糙,心內(nèi)外膜有出血斑點(diǎn),心耳及冠狀溝脂肪有豌豆大小出血點(diǎn),心臟色淡。少數(shù)心包腔、胸腔、腹腔有淡黃色積液,部分病例有纖維

39、素性滲出。脾多數(shù)腫大呈紫黑色、暗紅色或紫藍(lán)色,邊緣有出血性梗死灶,少數(shù)增大13倍,柔軟而易脆裂。胃和小腸黏膜有不同程度的充血和出血。腎臟輕度腫大,充血和出血,表面和切面均有小點(diǎn)出血,尤以腎乳頭多,在皮質(zhì)、髓質(zhì)交界處有黑紅色出血點(diǎn)。肝腫大、膽囊充盈,呈深黃色,肝表面有散在的芝麻大、黃豆大和蠶豆大化膿灶,切面外翻,肝實(shí)質(zhì)淤血。膀胱粘膜充血或有點(diǎn)狀出血。胰腺充血、漿膜與間質(zhì)炎性水腫。全身淋巴結(jié)有不同程度的腫大、充血和出血,有的腸系膜淋巴結(jié)為甚。少數(shù)病例在頸、背部等部皮膚潮紅,經(jīng)熱水浸泡刮毛后特別清楚,如“刮痧狀”。腦膜腦炎型：腦膜充血、出血,嚴(yán)重者溢血,少數(shù)腦膜下充滿積液,腦切面可見白質(zhì)和灰質(zhì)有明顯

40、的小點(diǎn)出血。部分病豬在頭頸、背、胃壁、腸系膜及膽囊壁有膠樣水腫。其他與敗血癥型變化差異不大。亞急性或慢性型：心內(nèi)膜炎時(shí),心瓣膜增厚,表面粗糙,在瓣膜上有菜化樣贅生物,常見于二尖瓣或三尖瓣,有時(shí)還見于心房、心室和血管內(nèi)。關(guān)節(jié)炎時(shí)關(guān)節(jié)紅腫,切開關(guān)節(jié)囊,滑膜充血,有出血點(diǎn),滑液稍混濁呈紅黃色,關(guān)節(jié)面粗糙。嚴(yán)重者,關(guān)節(jié)囊內(nèi)外有黃色膠凍樣液體或纖維素性膿性物質(zhì)8，9。3.2.3類癥鑒別 敗血癥型豬鏈球菌病易與急性豬丹毒、豬瘟相混淆，應(yīng)注意區(qū)別。 急性豬丹毒：采取脾、腎、血液涂片，染色鏡檢，可見到革蘭氏陽(yáng)性（呈紫色）小桿菌。 豬瘟：皮膚和腎有密集的小出血點(diǎn)，有膿性結(jié)膜炎，無(wú)跛行狀，病程較長(zhǎng)，各種治療無(wú)效。

41、 3.3 關(guān)于豬鏈球菌病防制病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)內(nèi)均帶有病原體，所以，首先應(yīng)加強(qiáng)對(duì)健康豬的免疫。鏈球菌是條件性致病菌,加強(qiáng)生豬飼養(yǎng)管理,合理搭配飼料,加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理體制,糞便發(fā)酵等,定期消毒,畜舍用消毒藥品交替使用,防止細(xì)菌的耐藥性。如畜舍用“百毒威”高效廣譜消毒劑常飲水消毒,噴霧毫升米,工作服、器皿等浸泡洗滌。%過氧乙酸噴霧消毒,消毒池稀釋,每天消毒液換次,過道用%氫氧化鈉每周消毒次20。另一方面，在發(fā)病后，加強(qiáng)病豬和健康豬的隔離，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所做的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。并且可選用中草藥治療也有很好

42、的療效。如豬群選用:二花、連翅、知母、沙參、陳皮、花粉、云苓、生地、甘草,一劑二煎一次灌服,日服一劑,連用二劑21。千里光、紫花地丁、金雞鳳尾草、板蘭根、楓楊、大葉桉、野菊花等對(duì)本菌有較強(qiáng)的抑制作用,可選用煎服22。 免疫預(yù)防:日齡苗豬頭份豬鏈球菌苗生理鹽水,每頭豬肌肉注射,間隔個(gè)月再免疫次,種公豬每年免疫次。對(duì)未發(fā)病的豬口服0.070.1克,服藥間隔時(shí)間小時(shí),連服天為一個(gè)療程。病豬隔離,病死豬無(wú)害化處理,深埋20。自家滅活疫苗預(yù)防:為了確保種豬場(chǎng)的安全,用本場(chǎng)分離的鏈球菌菌株制造滅活菌苗進(jìn)行預(yù)防接種。具體方法是用分離的鏈球菌接種于含牛血清的緩沖肉湯中,培養(yǎng)小時(shí),鏡檢無(wú)雜菌,活菌數(shù)為億,然后按常規(guī)制成滅活菌苗,免疫仔豬。經(jīng)過天后,用同源菌攻擊,結(jié)果能抵抗等量同源菌的攻擊。然后豬場(chǎng)用該滅活菌苗進(jìn)行了預(yù)防接種,豬場(chǎng)的豬群再無(wú)發(fā)病,豬群生長(zhǎng)正常23。做好生產(chǎn)種公、母豬的鏈球菌菌苗接種工作。病仔豬的母豬及可疑病豬及時(shí)淘汰。3.4結(jié)論3.4.1 從沈陽(yáng)市某種豬