高效液相色譜分析法課件

1、第二十章高效液相色譜分析法一、高效液相色譜法的主要類(lèi)型和原理二、高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇三、高效液相色譜儀四、高效液相色譜分析方法high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph2022/7/30 概述高效液相色譜法（high performance liquid chromatography；HPLC）是在60年代末，以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)展而成的分離分析方法。它與經(jīng)典液相色譜法的主要區(qū)別是：流動(dòng)相改為高壓輸

2、送、采用高效固定相、具有在線檢測(cè)器、儀器化。2022/7/30二、高效液相色譜法的特點(diǎn) feature of HPLC 特點(diǎn)：高壓、高效、高速 高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2022/7/30一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LC 與HPLC的主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 柱效低（H，n） 分析周期長(zhǎng) 無(wú)法在線檢測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH3.0 腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì) pH=37弱酸；pH=78弱堿；兩性化

3、合物2022/7/303、容量因子及其影響因素組分為弱酸時(shí)：流動(dòng)相pHpKa，k值變小， tR 減小。組分為弱堿：流動(dòng)相pHpKb，k值增大，tR增大;流動(dòng)相pHpKb，k值變小， tR 減小。流動(dòng)相的pH需在28之間，超出此范圍可能使鍵合基團(tuán)脫落。實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)及時(shí)用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗，以防腐蝕儀器流路系統(tǒng)。 2022/7/304、用途有機(jī)弱酸、弱堿與兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時(shí)的分離。不適用于pka8.0的堿。離子抑制色譜法與離子對(duì)色譜法比較ISCPICpka3.0的酸pKa 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚

4、 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022/7/305. 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。2022/7/30一) 流動(dòng)相對(duì)分離的影響高效液相色譜中，良好的固定相容易獲得，改善分離效果主要是靠選擇流動(dòng)相。主要受溶劑種類(lèi)的影響；k主要取決于溶劑的配比

5、。2022/7/30二) 溶劑的強(qiáng)度和選擇性1. 溶劑的極性和強(qiáng)度2. 混合溶劑的強(qiáng)度3. 溶劑的選擇性2022/7/30Snyder溶劑分類(lèi)法樣品組分、溶劑與固定相三者間的作用力為分子間作用力，組分的分配系數(shù)由三者的分子間作用力所決定。分子間的作用力可分為以下三類(lèi)：質(zhì)子受體作用力 參照物：乙醇質(zhì)子給予作用力 參照物：二氧六環(huán)強(qiáng)偶極作用力 參照物：硝基甲烷選擇以上作用力最強(qiáng)的常用溶劑作為參照，將81種常用溶劑分為八類(lèi)。2022/7/30Snyder溶劑分類(lèi)法選擇不同組別的溶劑，分子間作用力不同，容易造成組分間的分配系數(shù)的差別，使改變，以利于組分的分離。根據(jù)各類(lèi)參照物推算出常用溶劑的極性參數(shù)P/

6、和反相洗脫溶劑的強(qiáng)度因子S值。選擇不同極性參數(shù)P/的溶劑（正相）或不同強(qiáng)度因子S的溶劑（反相）進(jìn)行配比，優(yōu)化分離效果。2022/7/30三)溶劑最優(yōu)方法-四面體優(yōu)化法根據(jù)色譜類(lèi)型（正、反相）組成四面體；尋找被分離組分的容量因子k=3的等洗脫面ABC；將此等洗脫面視為正三角形按比例配制等洗脫強(qiáng)度的初試溶劑。用初試溶劑作為流動(dòng)相，進(jìn)樣，檢查分離效果，選擇最好的溶劑系統(tǒng)。2022/7/30色譜溶劑系統(tǒng)的四面體優(yōu)化法ABC0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67BDB/A/C/

7、AC2022/7/30應(yīng)用實(shí)例11種磺胺混合物的分離組成溶劑四面體甲醇、乙腈、四氫呋喃底劑：水B水乙腈甲醇四氫呋喃AC2022/7/30應(yīng)用實(shí)例11種磺胺混合物的分離尋找等洗脫強(qiáng)度面用ODS鍵合相柱與甲醇-水，分離上述混合物。經(jīng)數(shù)次調(diào)整配比，在甲醇-水（20.0:80.0）時(shí)，樣品中保留時(shí)間適中組分的k=3（或25）。 tR=t0(1+k)該號(hào)溶劑強(qiáng)度因子：Sab=3.00.2+00.8=0.6所有配比溶劑系統(tǒng)的強(qiáng)度因子都為0.6。2022/7/30應(yīng)用實(shí)例11種磺胺混合物的分離MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33

8、/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67按比例配制等洗脫強(qiáng)度的初試溶劑2022/7/30應(yīng)用實(shí)例MeOH-H2O(20:80)CAN-H2O (18.8:81.2)THF-H2O (13.3:86.7)MeOH-CAN-H2O (10.0:9.4:80.6)ACN-THF-H2O (9.4:6.6:84.0)MeOH-THF-H2O (10.0:6.6:83.4)MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0

9、.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.672022/7/30應(yīng)用實(shí)例11種磺胺混合物的分離用初試溶劑作為流動(dòng)相，進(jìn)樣，檢查分離效果最佳流動(dòng)相： MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)2022/7/30洗脫方式恒組成溶劑洗脫用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比。優(yōu)點(diǎn)： 縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測(cè)靈敏度。缺點(diǎn)： 有時(shí)引起基線漂移；重復(fù)性不佳。2022/7/30續(xù)前 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵） 類(lèi)似G

10、C的等溫度洗脫2）梯度洗脫： 在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類(lèi)和比例 即不斷改變其極性（兩個(gè)泵） 適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分 類(lèi)似GC的程序升溫（沸程較長(zhǎng)樣品）2022/7/30三、分離條件的選擇1 2022/7/30影響分離的因素 factors influenced separation1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。2022/7/30 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)

11、阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。2022/7/30 2.流速 流速大于0.5 cm/s時(shí), Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。 3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。2022/7/30一)高效液相色譜法的速率理論1.2022/7/30一)高效液相色譜法

12、的速率理論HPLC是將LC與GC基本原理和實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合而產(chǎn)生。兩者主要差別是流動(dòng)相性質(zhì)不同Van Deemter方程式： GC H=A+B/u+Cu 毛細(xì)管開(kāi)口柱 H=B/u+Cu HPLC H=A+Cu （流動(dòng)相是液體，粘度比氣體大的多，柱溫為室溫，而且流速至少是最佳流速的3-5倍，綜上原因可忽略縱向擴(kuò)散項(xiàng)）2022/7/30圖示back2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素渦流擴(kuò)散項(xiàng)AA=2dp降低固定相直徑dp (3-5m)降低。采用球形、仄粒度分布（RSD5%）固定相及勻漿裝柱。2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素縱向擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散系數(shù):因流動(dòng)相黏度大,組分的縱向擴(kuò)散系

13、數(shù)很小,縱向擴(kuò)散項(xiàng)可以忽略.2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素傳質(zhì)阻抗系數(shù)C GC C=Cs HPLC C=Cm+Csm+Cs化學(xué)鍵合相，固定液為鍵合在載體表面的官能團(tuán)的單分子層 HPLC C=Cm+CsmVan deemter方程在HPLC中的表現(xiàn)形式： HPLC H=A+Cmu+Csmu2022/7/30續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響 2022/7/302022/7/30HPLC分離條件的選擇采用小粒度、仄分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用勻漿法裝柱。采用低粘度流動(dòng)相，低流量（1ml/min）。柱溫以25為宜。太低，則使流動(dòng)相的粘度增加。用水溶液為流動(dòng)相的色譜法（如IEC）可按需升

14、溫。2022/7/30其他(自學(xué))正相鍵合相色譜的分離條件反相鍵合相色譜的分離條件反相離子對(duì)色譜的分離條件2022/7/30四 其他固定相(自學(xué))鍵合型離子交換劑手性固定相親合色譜固定相2022/7/30五、分離類(lèi)型選擇 choice of separation types2022/7/30第二十章高效液相色譜分析法一、輸液系統(tǒng)二、分離與進(jìn)樣系統(tǒng)三、檢測(cè)系統(tǒng)四 數(shù)據(jù)記錄處理和 計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)第三節(jié)高效液相色譜儀high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph2

15、022/7/30液相色譜儀（2）2022/7/30液相色譜儀（3）2022/7/30液相色譜儀（4）2022/7/302022/7/30二、高效液相色譜儀2022/7/30三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.流程2022/7/30第三節(jié) 高效液相色譜儀微機(jī)泵貯液瓶檢測(cè)器記錄器級(jí)分收集器預(yù)柱分析柱柱恒溫箱自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣器進(jìn)樣2022/7/30一、高壓輸液泵(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之

16、一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2022/7/30一、高壓輸液泵1、柱塞往復(fù)泵2022/7/30輸液泵的要求：無(wú)脈沖、流量恒定、流量可以自由調(diào)節(jié)、耐高壓、碉腐蝕、適于進(jìn)行梯度洗脫2022/7/30(2)梯度淋洗裝置外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/7/30二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng)完整的分離和進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣器、色譜柱、柱的進(jìn)出口接頭及至檢測(cè)器的導(dǎo)管。1、進(jìn)樣器 六通進(jìn)樣閥2022/7/301. 進(jìn)樣裝置 流路中為

17、高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/7/302022/7/30(4) 高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/7/30二、色譜柱2、色譜柱 分析型：內(nèi)徑24.6mm，柱長(zhǎng)1025cm 制備型：內(nèi)徑2040mm，柱長(zhǎng)1030cm3、色譜柱柱效的評(píng)價(jià) “色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)”給出分析狀態(tài)下色譜柱最小理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子。2022/7/30(5) 液相色譜檢測(cè)器2022/7/30三、檢測(cè)系統(tǒng)一) 檢測(cè)器的要求：靈敏度高;噪聲低;線性范圍寬;重復(fù)性好;適用化合物的種類(lèi)廣。2

18、022/7/30三、檢測(cè)系統(tǒng)可變波長(zhǎng)型檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器2022/7/30覆盆子指紋譜圖2022/7/30板藍(lán)根指紋圖譜2022/7/30三、檢測(cè)系統(tǒng)二)、紫外檢測(cè)器UVD優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，噪音低，不破壞樣品可用于制備，對(duì)溫度及流動(dòng)相流速波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：只能檢測(cè)有紫外吸收的樣品；流動(dòng)相選擇有一定限制，檢測(cè)波長(zhǎng)必須大于流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)。2022/7/30二) 紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)： 靈敏度高； 工作原理為L(zhǎng)amber-Beer定律 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選

19、，易于操作； 可用于梯度洗脫。 2022/7/301. 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器原理與紫外分光光度計(jì)類(lèi)似.2022/7/30可變波長(zhǎng)紫外光測(cè)定器示意圖2022/7/302. 光電二極管陣列檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/7/302022/7/30光電二極管陣列檢測(cè)器2022/7/30三) 熒光檢測(cè)器（fluorescence detector） 高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；2022/7/30四). 示差折光檢測(cè)器（d

20、ifferential refractive index detector） 除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器； 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2022/7/30示差折光檢測(cè)器2022/7/30五) 其他檢測(cè)器1. 安培檢測(cè)器2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器2022/7/30 第二十章 高效液相色譜 法一、定性分析方法二、定量分析方法三、高效液相色譜 分離方法的選擇 第四節(jié) 高效液相色 譜分析法high performance liquid chro

21、matograph2022/7/30第四節(jié)高效液相色譜分析方法一、定性分析方法色譜鑒定法化學(xué)鑒定法兩譜聯(lián)用鑒定法兩譜聯(lián)用法（離線）兩譜聯(lián)用儀（在線）2022/7/30二、定量分析方法(與GC類(lèi)似)1、外標(biāo)法以待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，對(duì)比求算試樣含量。工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)二點(diǎn)法進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確，否則宣布誤差大。外標(biāo)一點(diǎn)法只有在工作曲線通過(guò)零點(diǎn)時(shí)才準(zhǔn)確。2022/7/30二、定量分析2、內(nèi)標(biāo)法工作曲線法內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)對(duì)比法校正因子法。2022/7/30三、分離方法的選擇 choice of separation types2022/7/30 第二十章 高效液相色 譜分析法一、超臨

22、界流體色譜的特點(diǎn)與原理feature and principle of SFC二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structure and general process of SFC 三、超臨界流體色譜的應(yīng)用application of SFC 第五節(jié) 超臨界色譜high performance liquid chromatographsupercritical fluid chromatograph, SFC2022/7/30一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述 超臨界流

23、體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。2022/7/302. 超臨界流體性質(zhì)（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間。（2）可通過(guò)改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類(lèi)似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2022/7/303.原理 SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度），調(diào)整組分保留值；2022/7/30壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對(duì)分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的