酶免技術f教學內(nèi)容課件

1、第十四章 酶免疫技術第一節(jié) 酶免疫技術原理及分類 一、技術原理 二、分類第二節(jié)酶免疫技術要點 一、酶和酶作用底物 二、酶標記抗體或抗原 三、固相載體第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗 一、基本原理 二、方法類型及反應原理第四節(jié) 酶免技術應用小結標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術一、標記免疫技術標記免疫技術 標記免疫技術指用示蹤物標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應；并借助于熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結果直接鏡檢觀察或進行自動化測定；可以在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上，對抗原抗體

2、反應進行定性和定位研究；也可對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及標記技術酶免疫技術熒光免疫技術放射免疫技術化學發(fā)光技術金免疫技術生物素-親和素免疫放大技術 放射免疫技術發(fā)光免疫技術酶免疫技術三大經(jīng)典標記技術三大經(jīng)典標記免疫技術核心試劑: 酶標記的抗體或抗原酶標物特點： 免疫學活性 酶對底物的催化活性抗原抗體反應的特異性+酶高效催化反應的專一性、 放大性二、酶免技術原理及特點免疫技術： Ag +Ab AgAb 酶標記的免疫技術： Ag*+Ab Ag*Ab 標記物的作用有二：一是便于觀察反應結果，二是提高測定的敏感性 特點：靈敏度高、特異性強

3、、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析 酶免技術原理及特點三、酶免疫技術分類 酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均 相非均相（異相）固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位 液體標本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理（一）、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術酶擴大免疫測定技術EMITenzym

4、e-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫測定 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫測定EMIT示意圖毒品(如嗎啡及其衍生物) +溶菌酶 ；酶底物(藤黃微球菌)。酶的活性與待測樣品中抗原的量成正比，測定酶活性以標準曲線推算出待測抗原的量。 CEDIA示意圖酶的活性與待測樣品中抗原的量成反比。分類：液相酶免疫測定 固相酶免疫測定 以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結合的酶標記物（二）、非均相酶免疫測定第二節(jié)ELISA的技術要點

5、基本原理1.抗原或抗體的固相化 ；2.抗原或抗體的酶標記 ；3.受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。 三個核心試劑 免疫吸附劑（固相載體）酶結合物酶的底物 ELISA試劑盒組分（1）已包被抗原或抗體的固相載體；（2）酶標記的抗原或抗體（酶結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性

6、對照品和陽性對照品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液。標記酶的要求： 純度高、活性高 性質(zhì)穩(wěn)定 標記后不影響抗原或抗體的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量 酶的反應產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測簡便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、價廉 一、酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶）（無色）亞鐵血紅素（輔基）（暗棕色）主酶與酶活性無關 輔基是酶的活性中心RZ值：403nm （輔基）與275nm（主酶） OD值之比 （2.5-3.0）能被58%-62%飽和硫酸銨沉淀，pH3.5-12均較穩(wěn)定 ELISA中應用最為廣泛的標記用酶 常用

7、酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP） 菌源性AP 腸粘膜AP 半乳糖苷酶（-Gal） 用于均相酶免疫測定 常用酶酶和酶作用底物另：葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰膽堿酯酶等底物選擇：1.底物應該是無色，經(jīng)酶催化后有明顯顏色變化；2.所顯色澤易于洗脫；3.顯色后的產(chǎn)物要穩(wěn)定，定量檢測時所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應是可溶的；4.價廉、易得、無毒。酶和酶作用底物HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有多種 H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高 常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物 鄰苯二胺 OPD四甲基聯(lián)苯胺 TMB5-氨基水楊酸5-ASA 2,2-氨基-二(

8、3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應后顯藍色 ，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm ，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。 HRP的常見底物 酶和酶作用底物AP的底物 -Gal的底物 對-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）4-甲基傘酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm。 酶作用后，生成高強度熒光物 ，用熒光計測量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技術的核心組成部分 酶結合物（conjugate）酶標記物 通

9、過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的結合物 二、酶標記的抗體或抗原（一）抗原或抗體抗原要求純度高，抗原性完整天然抗原、重組抗原和合成肽?？贵w需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。多克隆和單克隆抗體。結合劑要求：1.不影響酶及抗體或抗原活性；2.不產(chǎn)生干擾物質(zhì)；3.結合效率要高；4.不出現(xiàn)非特異性反應；5.易得、價廉。（二）酶標記抗體或抗原制備方法要求技術方法簡單、產(chǎn)率高，重復性好標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性酶標記物穩(wěn)定 ，不形成聚合物酶標記抗體或抗原制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法酶標記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛

10、分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。 酶標記抗體或抗原 一步法：將25mg 純抗體與5mgHRP 混合于0.1mol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液1ml 中，4下用同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室溫下放置2h，在4下用0.05mol/L pH 8.0 Tris 緩沖液透析平衡，即可。 二步法：第一步將過量的戊二醛與酶反應，使酶僅與戊二醛結合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基與已結合酶的戊二醛分子上的另一活性基團結合，形成一分子酶和一分子

11、免疫球蛋白結合物。純化及鑒定標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度 常用的純化方法：Sephadex G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將游離和結合的酶標記物迅速分離的最常用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合到固相載體的表面 三、固相載體要求 吸附性能好 不參與化學反應 不影響免疫反應性 空白值低、透明度高 固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類塑料制品 （微量反應板）微顆粒膜載體 固相載體將抗原或抗體結合于固

12、相載體 一般ELISA包被用的緩沖液都是偏堿性的碳酸鹽緩沖液（pH9.6)，目的就是要讓被包被的蛋白質(zhì)暴露較多的陰性集團，更穩(wěn)定的吸附到板子上。 包被coating包被與封閉用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附封閉blocking洗滌液與稀釋液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫-20磷酸緩沖鹽水（PBS,pH7.4）。 終止液 常用的HRP反應終止液為硫酸。常用的AP反應終止液為碳酸鈉。四、固相酶免疫測定儀（酶標儀）比色測定波長、吸光度范圍、光學系統(tǒng)、檢測速度、震板功能、溫度控制、定性和定量的軟件，自動洗板、溫育、加樣450

13、nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗 底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離1234一、基本原理終止5固相的抗原或抗體 酶標記物（酶結合物） 酶反應的底物 三個必要試劑 二、方法類型及反應原理雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的方法1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法

14、測抗原1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競爭法 方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。 應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的方法洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結合YE間接法方法

15、 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法1、已知抗原吸2、加待檢物3、加酶標抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗體吸2、加待檢物3、加酶標的抗Ig4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法 應用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e

16、抗體(HBeAb)的檢測 ELISA檢測抗體的方法捕獲法 應用： 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法捕獲法 原理：抗人IgM鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體 底物顯色 洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，與特異性抗體結合4、加酶標抗體與特異性抗原結合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結合4、加酶標抗體無抗原結合，加底物不顯色第四節(jié) 酶免疫測定的應用均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的ELISA應用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如結核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。酶免疫