酶的定向進化課件

1、第十章 酶的定向進化第一節(jié) 定向進化簡介第二節(jié) 定向進化的應用第一節(jié) 定向進化簡介一、自然進化與定向進化二、理論來源三、概念四、定向進化的選擇策略一、自然進化與定向進化達爾文在物種起源中提出以自然選擇為基礎的進化學說，成為生物學史上的一個轉折點。1、自然進化 （1）環(huán)境壓力下物種朝著適應生存環(huán)境的方向發(fā)展；（2）漫長時間里通過DNA復制發(fā)生突變或通過重組，產生了遺傳多樣性；（3）自發(fā)、非常緩慢、自然選擇；2、定向進化在實驗室中模仿自然進化的關鍵步驟（突變、重組和篩選），在較短時間內完成漫長的自然進化過程，有效改造蛋白質，使之適于人類的需要。 人為引發(fā)、較短時間、人為選擇。3、定向進化的一般過程

2、細菌誘變50 0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C4、酶定向進化的意義酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質不適應工業(yè)生產的條件。選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進化技術重新設計及改進酶分子的結構和性質，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產的需要。二、理論來源利用基因工程原理在實驗室中模擬生物進化過程 待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用TaqDNA多聚酶不具有35校對功能的性質，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質的優(yōu)化酶(或蛋白質)，從而排除其他突變體?；瘜W進化生

3、物進化是蛋白質工程的新策略主要是利用分子生物學手段，在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，在事先不了解酶的空間結構和催化機制的情況下，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質的突變酶。 是一種在生物體體外快速模擬達爾文進化的、具有一定目的性和快速改造蛋白質的方法，相對于傳統(tǒng)的蛋白質的“理性設計”，酶的分子定向進化屬于蛋白質的非合理設計。三、定向進化概念定向進化=隨機突變+正向重組+選擇（或篩選）定向進化的過程（1）通過隨機突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；（2）導入適當載體后構建突變文庫；（3）通過靈敏的篩選方法，

4、選擇陽性突變子。這個過程可重復循環(huán)，直至得到預期性狀的酶。四、定向進化的選擇策略隨機突變策略易錯PCR、DNA改組和外顯子改組、體外隨機引發(fā)重組、交錯延伸、定位誘變篩選采用回交法1、易錯 PCR(error-prone PCR)通過改變PCR反應條件，使擴增的基因出現少量堿基錯配，從而導致目的基因的隨機突變?？刂艱NA的突變頻率。不足之處： 靶序列長度一般在0.5-1.0kb，應用范圍有限； 中性突變較多；且較為耗時、費力 獲得的DNA序列中堿基的轉換高于顛換。此法突變具有一定的密碼偏向性。連續(xù)易錯 PCR(Sequential error-prone PCR)將一次PCR擴增得到的有益突變基

5、因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復進行隨機誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產生重要的有益突變。2、DNA改組1994年，Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章，首次提出了DNA改組(DNA shuffling)技術。Stemmer以-內酰胺酶系統(tǒng)為試驗對象，用DNA改組，經過三輪篩選和兩次回交得到一新菌株，其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍，也遠高于易錯PCR的突變篩選結果。DNA改組是DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上

6、有性重組。通過改變單個基因(或基因家族)原有核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產物以新功能。是一種分子水平上的定向進化。因此也稱為分子育種。DNA改組的效果必須由改組后的基因表達產物的功能來驗證。因此，靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術成功與否的關鍵。 DNA改組原理DNaseI 產生隨機片段；隨機片段變性；隨機片段復性； 4. 延伸 反復重復 步后，可獲得全長 DNA 片段 2-4。DNA改組步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機片段化，即將目的基因（ 可以是單個基因或一組相關基因）酶切成隨機片段，這些隨機片段集合包含了來自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3末

7、端；（3）無引物PCR，具有互補3末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機互補進一步延伸；（4）有引物PCR，以上輪無引物PCR的產物為模板，加入基因兩端序列為引物，經過多輪PCR得到重排產物的集合為突變文庫；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進一步對突變文庫進行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復上述步驟進行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。 單個DNA改組技術原理示意圖(a)單個基因（b) 基因家族改組技術(family shuffling)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現，采用傳統(tǒng)的DNA改組

8、方法雖然能完成定向進化的目的，但其中隨機產生的多為點突變，且有益突變頻率低，導致篩選工作艱巨且進展緩慢。DNA家族改組是以來自不同種屬的同源基因作為重排對象進行DNA改組操作的技術。該技術打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進行DNA改組與常規(guī)突變技術相比，DNA改組有以下顯著優(yōu)點：DNA改組可在短時間內通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可以達到幾十kb；通過多輪篩選或選擇，可使有益突變迅速積累，導致功能的明顯提高；DNA改組從表型上早期進行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡化了操作程序；D

9、NA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機突變具有較大的優(yōu)勢，隨機突變的方法一般產生1%的良性突變，但DNA改組可產生13%的良性突變。DNA改組與常規(guī)定向進化的比較3、體外隨機引發(fā)重組法以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。反復進行上述過程，直到獲得滿意的進化酶性質。4、交錯延伸在PCR反應中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其反應時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經變

10、性的新生鏈再作為引物與體系內同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。反復進行，直到產生完整的基因長度，結果產生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。第二節(jié) 定向進化的應用一、提高酶分子的催化活力二、提高酶分子的穩(wěn)定性三、提高底物的專一性和增加對新底物催 化活力的進化五、對映體選擇性的定向進化六、變換催化反應專一性一、提高酶分子的催化活力酶活的高低反映一個生物催化與轉化過程反應速率的快慢，酶活越高，反應速率越快，反之則反應速率越慢。因此，實現較高的酶活是企業(yè)一直追求的目標。L天冬氨酸酶定向進化研究進行4輪易錯PCR，篩選了3000個菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天

11、然酶二、提高酶分子的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性對以酶為催化劑的有機合成非常重要，催化反應發(fā)生在水相也是如此。在有機合成過程中，作為生物催化劑的酶所處的真實條件同其進化的自然環(huán)境通常差異顯著，特別是在高溫、極端 pH 和非水相體系中進行的催化反應更加要求提高酶的穩(wěn)定性和活力。1、熱穩(wěn)定性T4溶菌酶11個不同的單點突變株將Tm提高0.8-1.4.8株大腸桿菌核酸酶HI單點突變中，7株Tm提高了0.7-4.22、pH穩(wěn)定性不同的酶有其不同的最適 pH 范圍，當反應體系的 pH 值達到其最適條件時，酶將發(fā)揮其最佳的催化效率，但當反應體系的 pH 不適宜時，酶的催化效率就會有所降低，在極端的pH 條件下，甚至會失去活性。3、非水相的穩(wěn)定性有機化學合成中酶的開發(fā)與應用越來越引起人們的重視，酶在非水相中的催化反應在各領域得到了廣泛應用，已成為酶學研究的主要內容之一。三、提高底物的專一性和增加對新底物催化活力的進化不同的酶具有不同的底物特異性，底物特異性的高低直接影響到底物與酶的結合效率，并進一步影響整個催化過程的反應速率。Gulick分離到了一株谷胱苷肽轉硫酶，對于癌癥治療中烷化劑的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌體呈現技術來增加谷胱苷肽轉移酶與親電底物結合力，沒有成功 四、對映體選擇性的定向進化對映體選擇催化