細(xì)胞增殖的分子調(diào)控

1、細(xì)胞增殖的分子調(diào)控1. Introduction*細(xì)胞周期（cell cycle）就是指細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂的周期，即細(xì)胞在一次分裂結(jié)束開(kāi)始生長(zhǎng)，到下一次分裂完成所經(jīng)歷的過(guò)程。 Section 1 Introduction*細(xì)胞增殖（cell proliferation）是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一，是生物繁育的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖的意義單細(xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個(gè)體數(shù)量的增加。多細(xì)胞生物由一個(gè)單細(xì)胞(受精卵)分裂發(fā)育而來(lái)， 細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物繁殖基礎(chǔ)。成體生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞， 維持個(gè)體細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)平衡和機(jī)體的正常功能。機(jī)體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴(lài) 細(xì)胞增

2、殖。1. Phases of Cell CycleG02. Characteristics of Cell Cycle PhasesG1期： 細(xì)胞周期的大部分時(shí)相處于G1期，動(dòng)物細(xì)胞一般為612小時(shí)。該期主要的生化活動(dòng)是合成RNA和蛋白質(zhì)S期： 此期一般持續(xù)68小時(shí)，其長(zhǎng)短主要由基因組的復(fù)雜度決定。該期主要的生化活動(dòng)是復(fù)制DNA。G2期： 是最短的時(shí)相。該期主要的生化活動(dòng)是合成一些與有絲分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)。M期： 該期很短，一般持續(xù)0.52小時(shí)。該期生化合成停止，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，一個(gè)母細(xì)胞分裂成2個(gè)子代細(xì)胞。細(xì)胞增殖過(guò)程中兩個(gè)最重要的事件： 細(xì)胞內(nèi)成分的復(fù)制 細(xì)胞的分裂 細(xì)胞必須確保DNA在沒(méi)

3、有損傷或損傷得到恢復(fù)的情況下被復(fù)制；一個(gè)細(xì)胞周期染色體只能被復(fù)制一次，復(fù)制的染色體要在正確的時(shí)間分離并被分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中。3. Checking Points of Cell CycleG1-S期檢查點(diǎn)：又稱(chēng)G1限制點(diǎn)（R點(diǎn)），決定細(xì)胞是否增殖。細(xì)胞在該檢查點(diǎn)對(duì)各類(lèi)生長(zhǎng)因子、促有絲分裂原以及DNA損傷等復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)進(jìn)行整合和傳遞，根據(jù)檢查結(jié)果決定細(xì)胞是否進(jìn)行分裂、發(fā)生凋亡或進(jìn)入G0期。S期檢查點(diǎn)：可阻止DNA受損的細(xì)胞進(jìn)行DNA合成。主要是檢測(cè)DNA是否發(fā)生損傷、損傷的DNA分子是否得到修復(fù)，從而避免異常的DNA得以復(fù)制傳代。G2期檢查點(diǎn)：阻止受損細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。是控制細(xì)胞進(jìn)入M

4、期的檢查點(diǎn)，可防止細(xì)胞攜帶著受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進(jìn)入有絲分裂。M期檢查點(diǎn)：阻止受損細(xì)胞進(jìn)行分裂，又稱(chēng)紡錘體組裝檢查點(diǎn)。監(jiān)控姊妹染色體是否已穩(wěn)定地附著在紡錘體上，若未通過(guò)檢查，細(xì)胞被阻止繼續(xù)進(jìn)行分裂。 直到前一過(guò)程依賴(lài)的物質(zhì)條件滿足后下一過(guò)程才能被激活。細(xì)胞周期中各關(guān)鍵點(diǎn)的轉(zhuǎn)換，是通過(guò)各種調(diào)控因子相互作用，構(gòu)成級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這一調(diào)控系統(tǒng)的核心是周期素依賴(lài)的蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）家族。該家族成員的順序激活和對(duì)關(guān)鍵底物的磷酸化促進(jìn)細(xì)胞周期的有序進(jìn)程。 G1-CDK 使RB蛋白磷酸化而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F,促進(jìn)G1期細(xì)胞

5、跨越限制點(diǎn)，向S期發(fā)生轉(zhuǎn)化。Cyclin-CDK對(duì)細(xì)胞周期G1、G1/S進(jìn)行調(diào)控 Leland HartwellPaul NurseTim Hunt 因發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)細(xì)胞周期調(diào)控基因而獲此殊榮。這些基因中有一個(gè)被命名為“起始（start）”，它在細(xì)胞周期調(diào)控的第一步中起著關(guān)鍵作用。哈特韋爾還引入了“檢測(cè)點(diǎn)（checkpoint）”概念，對(duì)理解細(xì)胞周期如何運(yùn)行和運(yùn)轉(zhuǎn)頗有幫助。 運(yùn)用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法首次鑒定、克隆出細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控子之CDK分子（周期素依賴(lài)性激酶）。他還發(fā)現(xiàn)CDK在進(jìn)化中高度保守，它可使其他蛋白質(zhì)磷酸化，從而使細(xì)胞沿著細(xì)胞周期不斷地進(jìn)行分裂。 第一個(gè)發(fā)現(xiàn)了周期素(cyclin)

6、，一類(lèi)蛋白質(zhì)，是CDK的調(diào)控分子。亨特在研究中發(fā)現(xiàn)，周期素在每次細(xì)胞分裂過(guò)程中均發(fā)生周期性的降解，后來(lái)證明這是細(xì)胞周期調(diào)控的一種普遍性的重要機(jī)制。三位學(xué)者對(duì)細(xì)胞周期研究的主要貢獻(xiàn) 2001年10月8日美國(guó)人LelandHartwell、英國(guó)人Paul Nurse、TimothyHunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1. Growth Factors and their Receptors生長(zhǎng)因子，如EGF、PDGF、TGF、FGF、NGF、IL-2等，與相應(yīng)的靶細(xì)胞膜受體結(jié)合后，即可通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞增殖過(guò)程。Section 2 Regula

7、tion of Cell CyclePDGF：一種較強(qiáng)的促有絲分裂的因子，能刺激細(xì)胞進(jìn)入增殖過(guò)程。大多數(shù)二倍體細(xì)胞的增殖需要PDGF。PDGFR：分子量約180kD，跨膜糖蛋白。受體具有TPK活性。靶蛋白有磷脂酶C等Fig. 受體酪氨酸激酶（RTKs）的6個(gè)亞族受體酪氨酸激酶PDGFPLCPKC 對(duì)基因的早期活化和晚期活化Smad2 SARASmad2Smad2Smad4Smad4P300Fast2P300Smad4Smad2Fast2-P-P-PP15、P21Smad6,7細(xì)胞膜胞漿核膜GSBetalycnEndoglin（TGF-）2TGF-途徑（）TGF-作用與EGF類(lèi)似TGF-具有刺激

8、細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞增殖的雙重性： 能刺激體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的增殖 降低cyclinE的表達(dá)，抑制cyclinE與CDK2形成復(fù)合物；通過(guò)p27與CDK結(jié)合，抑制CDK的活性Rb蛋白磷酸化受阻，細(xì)胞停留在G1期；誘導(dǎo)P15基因表達(dá)，增強(qiáng)抑制細(xì)胞增殖的效果。 EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程EGF：53個(gè)aa殘基，分子量6kD，分布于人的尿液、血液和乳汁。細(xì)胞增生Raf蛋白 具有絲蘇氨酸蛋白激酶活性.又稱(chēng)MAPKKK激活有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK)系統(tǒng)。 MAPK系統(tǒng) 是一組酶兼底物的蛋白分子，通常由三種蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)構(gòu)成，種類(lèi)較多，包括：MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)，如Raf-1激酶

9、。MAP激酶激酶(MAPKK)，如MEK1/2。MAPK，如ERK1/2。MAPKKKMAPKKMAPKMAPK途徑：2.細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子細(xì)胞周期蛋白(Cyclin) ：Cdk的正調(diào)節(jié)因子 周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,Cdks)：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié) Cdk抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)：Cdk的負(fù)調(diào)節(jié)因子 細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）：一類(lèi)伴隨細(xì)胞周期的不同階段表達(dá)、累積和降解的蛋白質(zhì)因子。 細(xì)胞周期蛋白盒(Cyclin box): 與Cdk結(jié)合，激活Cdk 的蛋白激酶活性降

10、解盒(Destruction box): 在Cyclin的自身降解中發(fā)揮或PEST序列（脯-谷-絲-蘇） 重要作用結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)控機(jī)理Cyclin與Cdk形成異二聚體：催化亞基為Cdk， 調(diào)節(jié)亞基為Cyclin。 The Expressional Levels of Cyclins during Cell CycleDestruction Box in Cyclins細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）的適時(shí)降解細(xì)胞周期蛋白合成后可被泛素修飾。兩個(gè)泛素-蛋白連接酶介導(dǎo)了多泛素化的過(guò)程： SCF（由Skp1、Cullin和F-box三種蛋白的首字母組成） 通過(guò)降解G1-S期 cyclin E控制G1-S期

11、 的轉(zhuǎn)換。 后期促進(jìn)復(fù)合體（anaphase promoting complex or cyclosome，APC/C） 通過(guò)Cdc20（APCCdc20 ）或Cdh1 （APCCdh1 ）介導(dǎo)作用于M期cyclin。APC/C將泛素轉(zhuǎn)移到位于cyclin降解盒C-端的賴(lài)氨酸殘基，進(jìn)一步泛素化形成多泛素鏈降解。如：有絲分裂期后期cyclin B的降解。 APC/C可被M期CDK磷酸化激活，活化的APC/C使cyclin B 泛素化修飾并被降解。由于cyclin B是CDK1的調(diào)節(jié)亞基，其降解使CDK1失活。 APC/C在G1期的活性一直很高，以確保S期和M期cyclin被徹底清除，保證有絲分裂

12、的完成。 APC/C在G1晚期失活，允許cyclin B和CDK1水平同時(shí)升高，使細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)入下一個(gè)有絲分裂周期。不同類(lèi)型的CDK/cyclin復(fù)合體Cyclin D包括D1-3，各亞型cyclin D在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。分類(lèi)：A-H細(xì)胞周期中不同類(lèi)型cyclin的表達(dá)變化周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（Cdks）：一類(lèi)Ser/Thr蛋白激酶，在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。人體細(xì)胞內(nèi)主要有Cdk1/Cdc2、Cdk26、Cdk7/CAK和Cdk8等。 活性中心：ATP結(jié)合部位；催化部位調(diào)節(jié)亞基Cyclin的結(jié)合部位：正調(diào)節(jié)P13suc1的結(jié)合部位：負(fù)調(diào)節(jié)，阻止細(xì)胞進(jìn)/退M期結(jié)構(gòu)

13、特點(diǎn)：3個(gè)主要功能域沒(méi)有酶量的調(diào)節(jié)：在整個(gè)細(xì)胞周期中，某一Cdk的含量恒定，其活化Cdk與非活化Cdk的總量不變。 CdK的結(jié)構(gòu)、：抑制性磷酸化位點(diǎn)；cyclin結(jié)合位點(diǎn)；ATP結(jié)合位點(diǎn)b: 催化部位: ATP結(jié)合位點(diǎn): T-loop；活性磷酸化位點(diǎn): 自身磷酸化位點(diǎn)Cyclin ACdk2CDK的分子量一般為3540kD，不同CDK的氨基酸組成有40%以上的同源性。典型的CDK催化亞基的活性中心約由300個(gè)氨基酸殘基組成，當(dāng)處于單體或非磷酸化狀態(tài)時(shí)，CDK沒(méi)有催化活性。 CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。在激活因素中，目前認(rèn)為CDK與周期蛋白的結(jié)合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸

14、化是較為重要的兩種調(diào)節(jié)因素；而在抑制因素中，CDK的N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的結(jié)合是主要的調(diào)節(jié)因素。Regulation of CDK ActivityActivation of CDK 周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”結(jié)構(gòu)域直接和CDK結(jié)合，并與CDK的激活相關(guān)，周期素是CDK的正性調(diào)節(jié)劑。周期素的這兩種功能是密切相關(guān)的，而這種結(jié)合與激活作用主要通過(guò)周期素在細(xì)胞周期中的濃度波動(dòng)來(lái)調(diào)控。CyclinA-CDK2 Complex with ATP Bound磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依賴(lài)于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr

15、161和CDK2的Thr160的磷酸化，就與這兩個(gè)酶的激活相關(guān)。 催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調(diào)節(jié)亞基為周期素H，另需一組裝蛋白因子MAT1以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Complex of CDK7 CyclinH-MAT1 Cyclin HCDK7MAT1Inhibition of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。其原因在于上述殘基的側(cè)鏈位于該酶活性中心ATP結(jié)合部位的頂端，因而對(duì)激酶的磷酸化作用產(chǎn)生了阻礙。催化Thr14和Tyr15磷酸化的是兩種不同的蛋白激酶，使Thr

16、14磷酸化的為蛋白激酶Myt1 ，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1 。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相對(duì)活性，決定CDK1和CDK2的活性高低。CDK activating組成、結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)：活化與非活化Cdk的比例正性調(diào)節(jié)：人Cdk與特定的Cyclin 結(jié)合才有活性；也只有Cyclin降解才能使Cdk最終失活。 負(fù)性調(diào)節(jié)：CKI與Cdk結(jié)合后阻止Cdk磷酸化。 共價(jià)調(diào)節(jié)：抑制性位點(diǎn)磷酸化失活(Wee1激酶)；去磷酸化復(fù)活(Cdc25磷酸酶)。協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：人Cdc2的Thr 160/161和Thr

17、14/Tyr 15磷酸化，可促進(jìn)Cdk-Cyclin結(jié)合。 這種磷酸化又依賴(lài)Cyclin，Cyclin與Cdk的結(jié)合可導(dǎo)致Cdk T環(huán)的移開(kāi)，暴露出其中的Thr 160/161位點(diǎn) 。 MPF activity controlled by:1) cyclin B levels2) phosphorylation of cdk1Multiple levels of regulation provide input for“checkpoint control”M-phase promoting factor = MPF =cdk1/cyclinBCDK激酶(CDK activating kina

18、se，CAK)：磷酸化Thr161Wee1激酶：磷酸化Tyr15/Thr14Cdk抑制蛋白(CKIs)Cdk抑制蛋白是Cdk的負(fù)調(diào)節(jié)因子，拮抗Cyclin的作用，阻止細(xì)胞經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)點(diǎn) 。（1）CIP/KIP(Kinase inhibition protein)家族：廣泛抑制Cdk1-, Cdk2-, Cdk4/6-Cyclin復(fù)合物。因其N(xiāo)端和C端分別具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，故又稱(chēng)雙重特異家族。包括p21、p27和p57CKI兩大家族（2） INK4(Inhibitor of cdk4)家族：特異性抑制Cdk4/6-D Cyclins，因其結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個(gè)具強(qiáng)烈疏水性的錨蛋白（ankyrin）重復(fù)序

19、列，故又稱(chēng)錨蛋白家族，包括p15、p16、p18和p19。 p21p21是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CKI基因(1993年)，其抑制作用最廣泛，對(duì)細(xì)胞周期各期的Cdks均有明顯的抑制作用。由于其表達(dá)蛋白質(zhì)分子量為21 kD，而且最初認(rèn)為它與野生型p53的生物活性有關(guān)，故命名為p21WAF-1(Wild-type p53 Activated Fragment-1)；后又發(fā)現(xiàn)p21與細(xì)胞老化等多種因素有關(guān)，故又稱(chēng)p21SDL1/Cip-1/CAP20/PIC1等。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CKI基因p21定位于6p21抑制作用最廣泛表達(dá)蛋白質(zhì)分子量為21 kDP21的功能可能作用于細(xì)胞周期的多個(gè)環(huán)節(jié)P21可與Cyclin、Cdk和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)組成四聚體。其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域與Cyclin-Cdk結(jié)合，抑制Cyclin-Cdk磷酸化Rb蛋白，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。當(dāng)細(xì)胞在S期發(fā)生DNA損傷時(shí)，p21的C末端結(jié)構(gòu)域與PCNA直接結(jié)合，抑制DNA聚合酶活性，阻止損傷DNA長(zhǎng)鏈的復(fù)制。但p21不能抑制DNA復(fù)制起始復(fù)合物的形成和DNA缺口的修補(bǔ)，所以，DNA的修復(fù)不會(huì)被抑制。p21基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有p53蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。p16p16又稱(chēng)MTS1基因（Multiple tumor suppres