哺乳細胞蛋白表達案例

1、哺乳細胞蛋白表達案例哺乳細胞蛋白表達案例實驗?zāi)康囊钥蛻籼峁┑哪康牡鞍谆驑?gòu)建表達載體，通過哺乳表達體系獲得目的蛋白X。實驗設(shè)計（1）分析客戶提供的目的蛋白序列，設(shè)計蛋白表達方案；（2）選擇鐘鼎特色載體pAZ-V5，構(gòu)建表達質(zhì)粒pAZ-V5-X；（3）轉(zhuǎn)染293F細胞進行蛋白表達，通過Western Blot檢測蛋白X是否表達；（4）通過Ni柱純化獲得目的蛋白X，SDS檢測純化蛋白純度，BSA方法測定蛋白濃度。蛋白分析（1）經(jīng)EditSeq翻譯目的蛋白X序列：m.w.=39.27kd，pI=8.52（2）經(jīng)UniProt匹配，蛋白X物種來源：草魚（3）目的基因稀有密碼子分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析目的基因

2、稀有密碼子分析蛋白親疏水分析 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析 蛋白信號肽預(yù)測分析結(jié)果： = 1 * GB3 目的基因不含哺乳表達體系稀有密碼子。 = 2 * GB3 目的蛋白整體呈親水性、無跨膜結(jié)構(gòu)域、無信號肽序列。結(jié)論：將目的基因構(gòu)建在鐘鼎特色載體pAZ-V5上，利用載體自帶信號肽分泌表達，并在目的蛋白C端添加His標簽便于純化。表達載體構(gòu)建 pAZ-V5-X質(zhì)粒酶切驗證：鐘鼎特色載體pAZ-V5酶切鑒定Marker: 250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,8000,12000Line1:酶切前質(zhì)粒Line2: 酶切后質(zhì)粒基因名稱：X（O

3、D260/OD280:1.82）酶切位點：EcoRI/BamHI4.2 pAZ-V5-X質(zhì)粒測序驗證：部分序列比對結(jié)果圖蛋白表達及純化純化蛋白Western Blot鑒定分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準1: 純化蛋白蛋白表達 Western Blot鑒定分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準1: 細胞裂解上清2: 細胞上清3: 細胞裂解上清（陰性）4: 細胞上清（陰性）純化蛋白X SDS膠灰度值分析 純化蛋白X SDS(reduced)分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準1: 純化蛋白蛋白內(nèi)毒素檢測凝膠半定量試驗：平行管供試品稀釋倍數(shù)陰性對照陽性對照反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+-+1:2（0.5）-0.301-0.3010.5（1：2）2+-+1:2（0.5）-0.301純化蛋白內(nèi)毒素濃度=鱟試劑靈敏度反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)的幾何平均值 =0.03EU/ml2=0.06EU/ml實驗結(jié)論目的蛋白X在293F細胞