PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹

1、PCR引物設計及相關軟件使用PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹主要內(nèi)容PCR介紹引物設計原理引物設計的優(yōu)化原則Primer Premier 5.0 介紹舉例說明引物的設計PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹抗癌抗衰老的紫色西紅柿PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹補鈣的胡蘿卜PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹滿地盡是黃金米幫孩子保護眼睛PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹抗凍的草莓會有魚腥味么？PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹帶有胰島素基因的生菜PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹當蘋果愛

2、上葡萄的時候PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹散發(fā)檸檬香味的西紅柿PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹富含多種維生素 玉米中的超級精英PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹一切只是幻想？一切皆有可能！PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹基因分離酶切載體酶切基因和載體連接導入細菌重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達等研究導入植物細胞基因工程的基本流程PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹PCR介紹1、什么是PCR2、PCR的組成3、如何提高PCR成功率 （定量，對照）PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物

3、設計原理 引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物設計總體上包含三個程序：序列下載，同源性比較，引物設計篩選 。PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則1、引物長度 大多數(shù)應用的最短引物長度為18個核苷酸。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618)的引物；若產(chǎn)物長5 kb，則用24個核苷酸的引 物。有人用2023個核苷酸引物得到40 kb的產(chǎn)物。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則2、引物GC含量 GC含量在40%60%之間，以4

4、5-55為宜。這可為有效退火提供足夠熱。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則3、引物Tm 引物所對應模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之間。 Tm=2(A+T)+4(C+G)PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則4、引物3端引物3末端和模板的堿基完全配對 防止一對引物內(nèi)的同源性 考慮末端5個堿基的G 引物3端要避開密碼子的第3位 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則5、引物序列與模板序列組成的相似性 可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高 。PCR引物設

5、計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則6、最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則7、引物自身及引物之間不應存在互補序 列 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則8、堿基

6、要隨機分布 引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則9、引物應具有特異性 引物設計完成以后，應對其進行檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則10、G值 G值(自由能)反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯誤引發(fā)。 P

7、CR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則11、引物的5端 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾，引物5 端修飾包括：加酶切位點、標記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計的原則12、在DNA測序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹Primer Premier 5.0 簡介主要功能:1、即引物設計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA 基元(motif)查

8、找4、同源性分析PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹使用介紹Preimer Premier 啟動界面Load sequencePCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物設計界面First you can design t

9、he primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primerPCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物搜索選項設定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹搜索結果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimerPCR引

10、物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物編輯PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹引物編輯Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main windowPCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹任務用綠色熒光蛋白(GFP)標記蛋白NR1舉例說明PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹SPBamHINR1Plasmi

11、d 1:Plasmid 2GFPPCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹SPBamHI(GGATCC)NR1-1aGFPPCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatc

12、c 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cct

13、gtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga g

14、aaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的編碼序列(4000bp)紅色為信號肽, 藍色為BamHI酶切位點, 下劃線標出酶切位點的閱讀框 PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GG

15、CCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCAC

16、AACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)PCR引物設計及P

17、rimer5.0相關軟件使用介紹引物要求PCR擴增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點保證NR1的閱讀框不改變PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT

18、5Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：擴增GFP基本序列變性, 引物復性PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGG

19、CGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹第三步：酶切位點Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）BamHI: ggatccPrimer1: 5 ggatccATGGTGA

20、GCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC PCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc accc

21、acaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPCR引物設計及Primer5.0相關軟件使用介紹atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg cca