2011級碩士實驗課 ELISA

1、免疫學(xué)實驗課1第二次實驗課酶聯(lián)免疫吸附試驗 2間接法ELISA實驗原理EEE已知抗原包被酶標板加入未知抗體（一抗）加入酶標抗體（二抗）加入底物，顯色封閉洗板洗板3實驗分組每組一塊40孔的酶標板每人一行4實驗試劑與器材試劑：封閉液(1%PBS-BSA) 7ml洗液(PBS-Tween20) 1瓶抗OVA抗體 2支酶標抗體(HRP-GaM) 5ml底物 5ml終止液(H2SO4) 2.5ml器材：酶標板 1塊200l pipette 1把1000l pipette 1把Tip (大/小) 若干1.5ml EP管 若干培養(yǎng)箱37 1個吸水紙 若干5包被：用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原

2、(OVA，10g/ml)稀釋。100 l/well加入聚苯乙烯酶標板中，4 over night。次日，棄去孔內(nèi)溶液。封閉：加入150 l/well 1%PBS-脫脂奶粉，37 for 40mins。加一抗：棄去封閉液，加倍比稀釋的抗體100 l/孔（稀釋與加板方法見后) 37孵育40mins ；孵育結(jié)束后，用PBS-T洗三次。 酶抗：酶標抗體 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置37孵育40mins，用PBS-T洗三次。顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液100l/well。 終止：加50 l/well2M硫酸(終止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼觀察

3、：與陰性對照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽性孔，相對應(yīng)的抗體稀釋度為該抗體的效價。酶標儀測量： 490nm濾光片下測光吸收值(A)，與陰性對照A值相比其比值2，相對應(yīng)的抗體稀釋度為該抗體的效價。 實驗步驟6包被固相支持物：聚苯乙烯和聚氯乙烯有較強的非特異性物理吸附蛋白質(zhì)的特性，被吸附的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)活性不發(fā)生改變（Ag-Ab結(jié)合）包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液（pH9.6）磷酸鹽緩沖液（pH7.2） Tris-HCL緩沖液（pH7-8）包被溫度、時間：4 18-24小時包被抗原濃度：10ug/ml7封閉的作用包被時所用的抗原或抗體濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白

4、質(zhì)充填這些空隙，從而防止非特異性吸附，影響結(jié)果的準確性。如圖：8CoatingBlockingEEEEAfter blockingAfter blockingEEWithout blocking封 閉 的 作 用9最常用的封閉劑：0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA）10%的小牛血清1%明膠10包被：用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原(OVA，10g/ml)稀釋。100 l/well加入聚苯乙烯酶標板中，4 over night。次日，棄去孔內(nèi)溶液。封閉：加入150 l/well 1%PBS-脫脂奶粉，37 for 40mins。加一抗：棄去封閉液，加倍比稀釋的抗體100 l/孔（

5、稀釋與加板方法見后) 37孵育40mins ；孵育結(jié)束后，用PBS-T洗三次。 酶抗：酶標抗體 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置37孵育40mins，用PBS-T洗三次。顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液100l/well。 終止：加50 l/well2M硫酸(終止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼觀察：與陰性對照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽性孔，相對應(yīng)的抗體稀釋度為該抗體的效價。酶標儀測量： 490nm濾光片下測光吸收值(A)，與陰性對照A值相比其比值2，相對應(yīng)的抗體稀釋度為該抗體的效價。 實驗步驟11抗體的稀釋方法1.準備7個稀釋管，做好標記。2.

6、每管加入PBS 500ul。3.取出抗體原液500ul加入第一管，混勻后，取出500ul加入第二管，依此類推至第七管。12加樣方法12空白空白依此類推10:空白對照1:陰性對照抗原（OVA）一抗（血清）酶標二抗-+-陰性空白空白+2:陰性對照+-+陰性13洗 液（PBS-T）磷酸鹽緩沖液：（PBS）吐溫20（Tween 20):非離子型表面活性劑抑制蛋白質(zhì)非特異性吸附于塑料表面14標記抗體常用的酶辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 15顯色原理常用的供氫體： 鄰苯二胺 OPD 四甲基聯(lián)苯胺 TMB ABTS DH2 + H2O2HRPD + 2H2O16注意事項加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，避免出現(xiàn)氣泡。加樣器頭不能混