TNF-α單抗體內(nèi)體外試驗(yàn)報(bào)告

1、細(xì)胞試驗(yàn)TNF-a細(xì)胞毒性體外中和實(shí)驗(yàn)1培養(yǎng)L929細(xì)胞2待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底 80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶/EDTA在 37 C消化細(xì)胞2min。計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，分裝至96孔培養(yǎng)板中，每孔約2X104 細(xì)胞，加入0.1ml1640培養(yǎng)基，37 C、5%CO2培養(yǎng)過夜。3在另一 96孔板中設(shè)置如下實(shí)驗(yàn)組：A組：將0.05ng TNF-%與倍比 稀釋的純化單抗（0-100區(qū)g/ml混合。B組：將0.05ng TNF- %與倍比稀 釋的抗TNF-%單抗（0-100區(qū)g/ml混合。C組：含有倍比稀釋的純化單 抗（0-100 w g/ml） P 組：只含有 0.05 ng TNF-oo N組：只有 1

2、640 培養(yǎng) 基。各組加入200區(qū)l 1640W養(yǎng)基和終濃度1g/m的放線菌素D,37C、 5%CO2孵育2h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。4棄去細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，將上述混合物加至孔內(nèi)，37C、5%CO2 培養(yǎng)24 ho5在孔內(nèi)加入10 MTT顯色液，石K續(xù)培養(yǎng)6h后，棄去培養(yǎng)液，加入 100 W l DMS慳止反應(yīng)并溶解藍(lán)色結(jié)晶，用PBS調(diào)零，測(cè)定A570值。6 細(xì)胞毒性按如下公式計(jì)算：細(xì)胞毒性 （%）=100-A570（A,B,P）/A570N 100%;細(xì)胞毒中和率按如下公式計(jì) 算：細(xì)胞毒中和率（）=100-（細(xì)胞毒性（A,B）/細(xì)胞毒性P）M00%。7半數(shù)抑制濃度（IC50）是能夠中和一半T

3、NF- %細(xì)胞毒作用時(shí)的scFv 濃度。參考文獻(xiàn) 山西醫(yī)科大學(xué)博士畢業(yè)論文利用噬菌體表面展示技術(shù)制備抗人腫瘤 壞死因子單鏈抗體及其人源化改造2004類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物造模方法佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis , AA)模型1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar大鼠50只，雄性，清潔級(jí)，周齡8-12周，體重140160g 2方法分組將50只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為 5組，分別編 號(hào)IV組，每組 10只。I組為正常對(duì)照組，II組為單純?cè)炷＝M (AA+NS),m組為造模+甲氨喋吟組(AA+MTX), IV組為造模+益賽普 低劑量組(0.44mg/kg), V組為造模+益

4、賽普高劑量組(0.88 mg/kg)。 全部大鼠于層流架中飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。大鼠AA模型的建立在完全弗氏佐劑中加入卡介苗，用 20ml注射器、8號(hào)針頭反復(fù) 抽吸，充分乳化，將其配置為10 mg/ml濃度(原CFA中卡介苗濃度 為1 mg/ ml)的水包油乳劑。造模實(shí)驗(yàn)第一天在第H、m、IV、V組大鼠的尾根部皮下注射 該乳劑0.2ml致炎。誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎，而正常對(duì)照組大鼠的尾根部 皮下注射等量生理鹽水。給藥于致炎后第12天至第23天IV、V組皮下注射益賽普，IV組 予以益賽普0.44mg/ kg.d, V組予以益賽普0.88mg/kg.d。給藥容積 均為0.1ml/100g體重。連續(xù)12天

5、。田組大鼠給予甲氨喋吟 2.7mg/ kg.w灌胃，I組大鼠蒸儲(chǔ)水灌胃0.5ml/只.d;給藥時(shí)間均固定在每天 上午9: 00。一般狀態(tài)的觀察及關(guān)節(jié)腫脹度的評(píng)定觀察各組大鼠的體重、飲食及活動(dòng)狀態(tài)的變化，體毛色澤改變，關(guān)節(jié)紅腫情況，與實(shí)驗(yàn)的第 0d, 3d, 6d, 9d, 12d, 15d, 18d, 21d, 24d, 27d用排水法測(cè)右足體積，分別測(cè)量 3次，取平均值，并根據(jù) 關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行AI的評(píng)定。血漿TNF-%檢測(cè)血漿TNF- 0c濃度的檢測(cè)采用雙抗體夾心 ELISA試劑盒?；そM織TNF- %表達(dá)滑膜組織標(biāo)本切片免疫組織化學(xué)染色。AA大鼠滑膜組織病理學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以x

6、士 s表示，應(yīng)用SPSS13.旅計(jì)軟件做統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，相關(guān)性用直線相關(guān)分析。以P0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)河北醫(yī)科大學(xué)碩士畢業(yè)論文腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白對(duì)大 鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎及血清與滑膜中 TNF- %、HIF-1 0c和VEGF表達(dá)的影2008克羅恩氏病動(dòng)物造模方法 三硝基苯磺酸法炎性腸?。╥nfammatory bowel disease , IBD）是一類嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的慢性疾病， 根據(jù)其病理特征可分為克羅恩氏?。–rohn s disease CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis ,UC）1。三硝基苯磺酸（TNBS）

7、誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，是研究 舊D最常用的鼠類模型之一。模型最早由Morris等14于1989年在大鼠上建立，而后又于1995年在小鼠15上成功誘導(dǎo)。模型以直腸給藥的方式，將TNBS與酒精的混合物灌入動(dòng)物結(jié)腸中誘導(dǎo)炎癥。其中酒精用來破壞腸黏膜屏障，從而使TNBS能夠進(jìn)入腸壁，并與腸道細(xì)菌和機(jī)體自身蛋白作用形成抗原，誘導(dǎo)免疫致敏反應(yīng)。模型建立后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、體重減輕、腹瀉、便血、腸壁增厚等癥狀。其免疫反應(yīng)以TH1型反應(yīng)為主，表現(xiàn)為細(xì)胞因子如腫瘤抑制因子a（TNF-a）干擾素丫（IFNy、）白介素12 （IL-12）等分泌水平上調(diào)16試齊I：TNBS致敏液：濃度為1 mol/L的TNBS

8、（Sigma公司）水溶液、水、無水乙醇按體積比 3.5: 11.5: 15混合， 制成含3.5%TNBS的50%酒精溶液；麻醉劑：戊巴比妥鈉（Sigma公司） 按照質(zhì)量體積比配成 1%溶液；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution , PBS）; 10%中性甲醛 固定液；便隱血檢測(cè)試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；小鼠灌腸（胃）針頭及100屋微量注射器（上海玻利鴿工貿(mào)有限公司 ）。腸炎誘導(dǎo)操作：戊巴比妥鈉按照體重 0.01 ml/g ,腹腔注射麻醉小鼠。用連有灌腸針的微量注射器抽取 TNBS致敏液60r 小心的將針頭探入小鼠肛門內(nèi)，深至 34 cm,過程中避免碰傷腸壁，

9、 緩緩?fù)迫胨幰?。?duì)照組給予相同體積的50%酒精溶液，灌腸完畢后緩慢拔出針頭。為確保致敏液與腸道充分作用，將小鼠頭朝下，固定在一個(gè)45o角傾斜的平面上，靜置30 min。間隔1 h后，再進(jìn)行一次同樣的給藥操作。小鼠蘇醒后，將小鼠放回籠中。另外建模的方式還有惡吵酮腸炎模型，選用雄性20 - 25 g S JL/ J小鼠（6 - 8周齡）予乙醒一過性麻醉后 ，經(jīng)肛門插管深入距肛緣 4 cm處，緩慢注入惡口坐酮150（1 L （6 mg溶于50 % 乙醇中），為確保注入的惡唾酮在結(jié)腸內(nèi)彌散分布，可將小鼠尾巴提起持續(xù)倒置 30 so 3 d后處死可見結(jié)腸產(chǎn)生 UC的病理改變，組織學(xué)特征和分布與人類 UC

10、類似。結(jié)腸炎動(dòng)物模型研究證實(shí)依那西普與英夫利昔抑制腸上皮細(xì)胞凋亡的能力相當(dāng)Fries W, et al. Int J Med Sci. 2008;5:169-80.目前認(rèn)為上皮細(xì)胞屏障喪失完整性是克羅恩病(CD)發(fā)病制中的第一步，腸上皮細(xì)胞的凋亡率是腸粘膜屏障功能的決定因素之一。TNF-alpha作為克羅恩病的主要促炎介質(zhì)之一，是啟動(dòng)腸上皮細(xì)胞凋亡程序的外部信號(hào)。本研究目的是要弄清楚實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎對(duì)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響，以及兩種TNF拮抗劑(英夫利昔和依那西普)的治療作用。另外還要檢驗(yàn)TNFR1(-/-)小鼠中TNFR1的重要性。結(jié)果顯示，給藥3小時(shí)以及 6小時(shí)后，英夫利昔和依那西普均可有效降低游離型TNF-alpha水平(與基線相比，兩種處理均達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，p0.01)。用TUNEL染色以及免疫組化檢測(cè) FasL、Bax的表達(dá)水平來評(píng)估回腸腸上皮細(xì)胞凋亡，結(jié)果提示動(dòng)物模型腸上 皮細(xì)胞凋亡率在腸炎誘導(dǎo)劑處理后第3、第6小時(shí)上升。TNF拮抗劑治療組以及 TNFR1(-/-)動(dòng)物卻沒有這些現(xiàn)象。抗