細胞生長狀況有關(guān)指標的檢測方法

1、細胞生長狀況有關(guān)指標的檢測方法一、細胞計數(shù)這是細胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為細胞計數(shù)板。巴氏吸管和顯微鏡。 步驟如下。l取清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕擦干。l取細胞懸液0.3ml，加入0.9結(jié)晶紫染液，混勻后滴半滴于細胞計數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或 出現(xiàn)氣泡。l在顯微鏡下用10X物鏡觀察計數(shù)四角大方格中的細胞數(shù)。代入下式得出細胞密度。細胞數(shù)（ml） = （4大格細胞數(shù)之和/4）X104X稀釋倍數(shù)臺盼藍染色法可計算出活細胞和死細胞數(shù)以測定細胞存活百分率。一般0.5%-1.0% 的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不

2、著色。此外還可用0.02%的藻紅b染液將死細 胞或受損細胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑絲。細胞存活率=4大格活細胞數(shù)/ （4大格活細胞數(shù)+4大格死細胞數(shù)）X100%在進行細胞計數(shù)操作時，必須把細胞懸液準備好，細胞應(yīng)分散良好，并充分混勻， 若出現(xiàn)較多細胞團或細胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/100mm2時，需重制細胞懸液，重 新計數(shù)。二、細胞生長曲線和生長倍數(shù)細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標，是測定細胞絕對增值數(shù)值和生長繁 殖基本規(guī)律常用的簡便方法。常用的方法為：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種等量的同一代細 胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24h取出幾瓶細胞進行計數(shù)，以培養(yǎng)

3、時間為橫坐標，不同時刻的細胞數(shù)的 對數(shù)為縱坐標，標出各點并連成線，即為該細胞的生長曲線，可反映出細胞生長的動態(tài)。測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)1周 （7天），期間逐日檢測一組，計數(shù)，最后把7天中的細胞數(shù)值繪成圖，即為細胞生長曲線。也可采用MTT法來進行生長曲線測定。標準的細胞生長曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細胞數(shù)有所減少，經(jīng)過一 段時間的潛伏期，再進入對數(shù)生長期，達到平臺期后生長穩(wěn)定，最后衰老。細胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)1個生長周期達到最大活細胞濃度比例。生長倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細胞數(shù)濃度/接種時的活細胞濃度三、細胞分裂指數(shù)細

4、胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測的1000個細胞中的分裂細 胞數(shù)來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1-2h后，玩染色制片法制片并染色，計算 1000個細胞中分裂象的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。l細胞準備。用支持物蓋片培養(yǎng)法。l每24h取出一個小蓋片，按常規(guī)方法進行固定，吉姆薩染色或HE染色，封片，制成永久標本。l顯微鏡下選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞并計數(shù)。逐個視野進行，對每一時間組的蓋片各取細胞多、中、少的區(qū)域各一個，共計算000個細胞，計算出平 均分裂細胞所占百分比。觀察時要掌握好分裂象標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期 和間期等的界限，以減少誤差。細

5、胞分裂指數(shù)二分裂細胞數(shù)/細胞總數(shù)（1000）X1000 next四、細胞接種存活率細胞接種存活率又稱細胞貼壁率。它是下?lián)鼙恢瞥煞稚⒌膽乙汉?，以低濃度?-5 個/cm2）接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群（克?。┑募毎俜謹?shù)值，用以表 示細胞的生存能力和細胞群的活力。l取對數(shù)生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數(shù)后按檢測細胞生長曲線接種細胞的原則，將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，接種12-15瓶。l每2h取出一瓶，倒掉培養(yǎng)科，然后加入胰酶消化已貼壁細胞，計數(shù)已貼壁細胞，用下面的公式逐個計算每個時間上的貼壁率。每2h一次，共觀察24h即12次。接種存活率（貼壁率）=（貼壁村活細胞數(shù)/接種細胞數(shù)）X

6、 100%五、克隆形成率細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能 增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增值活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎?體依賴性和增值能力兩個重要性狀，由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大， 一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率低，傳代細胞系高；二倍體細胞克隆形成率低，轉(zhuǎn)化細胞系高；正常細胞克隆形成率低，腫瘤細胞高。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成 率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在皿中，持續(xù)1周，隨時檢查，到 細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。1、平板克隆形成試驗l取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋

7、白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中備用。l將細胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋，以適當?shù)募毎麧舛冉臃N于培養(yǎng)皿中。一般按每皿50個、100個、200個細胞的梯度密度接種于含10ml 37C預(yù)溫培養(yǎng)基的皿中，并輕轉(zhuǎn) 動，使細胞分散均勻。置于37C、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2-3周。l經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或醋酸/甲醇（1： 3） 5ml，固定15min。然后去固定液，加適 量吉姆薩應(yīng)用染液染10-30min，然后用流水緩慢洗去染液，空氣干燥。l將培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼

8、直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡下計數(shù)大于10個細胞的克隆。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細胞）X100%平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料的 瓶。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團， 接種密度不能過大。2、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗l取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1X106個/L。然后根據(jù) 試驗要求做梯度倍數(shù)稀釋。l用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低熔點軟瓊脂，高壓滅菌后，維持在40 C中不會凝固。l按1： 1比例讓1.2%的瓊脂糖液和2XDMEM培養(yǎng)基混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中，冷卻凝固作為底層瓊脂，置CO2恒溫箱中備用。l按1： 1比例讓0.7%瓊脂糖液和2XDMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層的平皿中，逐漸形成雙瓊 脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)10-14天。把平皿放