紫薇葉天然抗氧化物的提取

1、浴:】宗人尢亨班級(jí)：應(yīng)用化學(xué)112姓名：周明杰學(xué) 號(hào)：201111030216指導(dǎo)老師：王志坤紫薇葉總黃酮的超聲提取及其抗氧化研究周明杰201111030216理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)112班摘要：目的探討紫薇葉中總黃酮的提取、鑒別方法及對(duì)超氧陰離子自由基的清 除能力，以充分利用紫薇葉植物資源，避免資源的浪費(fèi)。方法采用超聲波乙醇浸 提法從紫薇葉中提取黃酮類化合物，用分光光度法測(cè)定黃酮類化合物的總含量， 并利用對(duì)羥自由基的清除能力來進(jìn)行紫薇葉總黃酮的抗氧化性的研究。結(jié)果測(cè)得 樣品中黃酮類化合物的總含量為C = 0. 292mg/ml，回收率為72.01%，其純度和 產(chǎn)率均較高。結(jié)論該方法采用全物理過程，無

2、任何污染，是提取紫薇葉中黃酮類 化合物的有效途徑。紫薇葉黃酮類化合物提取液對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的OH自由 基有很好的清除作用。關(guān)鍵詞：紫薇葉；總黃酮；鑒別；超聲波提??；清除；自由基紫薇，別名入驚兒樹、百日紅、滿堂紅、癢癢樹。為千屈菜科紫薇屬雙子 葉植物。產(chǎn)于亞洲南部及澳洲北部。中國(guó)華東、華中、華南及西南均有分布， 各地普遍栽培。紫薇樹姿優(yōu)美，樹十光滑潔凈，花色艷麗；開花時(shí)正當(dāng)夏秋少 花季節(jié)，花期極長(zhǎng)，由6月可開至9月，故有“百日紅”之稱，又有“盛夏綠遮眼， 此花紅滿堂”的贊語(yǔ)，是觀花、觀干、觀根的盆景良材。紫薇也是河南安陽(yáng)市、 湖北襄陽(yáng)和山西晉城市市花。紫薇常見的名字為百日紅，因百日紅的含義

3、較好，所以人們廣泛稱為百日 紅，耐旱、怕澇，喜溫暖潮潤(rùn)，喜光，喜肥，對(duì)二氧化硫、氟化氫及氮?dú)獾目?性強(qiáng)，能吸入有害氣體，中性土或偏酸性土較好。據(jù)測(cè)定，每千克葉能吸硫10 克而生長(zhǎng)良好。紫薇又能吸滯粉塵，在水泥廠內(nèi)距污染源200250米處，每平方 米葉片可吸滯粉塵4042克。因此，它是城市、工礦綠化最理想的樹種，也可作盆 景。紫薇還具有藥物作用，李時(shí)珍在本草綱目中論述，其皮、木、花有活 血通經(jīng)、止痛、消腫、解毒作用。種子可制農(nóng)藥，有驅(qū)殺害蟲的功效。葉治白 痢、花治產(chǎn)后血崩不止、小兒爛頭胎毒，根治癰腫瘡毒，可謂渾身是寶。本文首次將超聲技術(shù)用于紫薇葉總黃酮的提取當(dāng)中，同時(shí)對(duì)黃酮提取物 進(jìn)行體外抗氧化

4、性研究，為紫薇葉的有效利用提供了一些理論依據(jù)。1材料與儀器1材料、試劑與儀器紫薇葉采自浙江農(nóng)林大學(xué)校園，將采集來的紫薇葉置于自然狀態(tài)下風(fēng)干，然 后再置于粉碎機(jī)磨細(xì)至全部能通過10目篩的細(xì)末。用標(biāo)準(zhǔn)篩選，截取能通過40 目篩但不能通過60目篩的部分，風(fēng)干，貯于具有磨砂玻塞的廣口瓶中，瓶上貼好 標(biāo)簽，注明樣品名稱、來源、采樣日期等。留供分析試驗(yàn)用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。石油醚、丙酮、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、硫酸亞鐵、 雙氧水、PBS緩沖溶液(pH7.4)、鄰二氮菲、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(tris) 等均為國(guó)產(chǎn)分析純，并由華東醫(yī)藥股份有限公司提供。T-6新世紀(jì)

5、紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn))；KQ-250DB型超聲波清洗儀（西安安泰儀器科技有限公司）；SHZ-C循環(huán)水式 多用真空泵（河南鞏義市宇翔儀器有限公司）；DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱（上海精 宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZG-6050真空干燥器（上海森信實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； BS224S型電子分析天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司），R201B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （江蘇金壇市白塔石英玻儀廠）。2方法與結(jié)果2.1紫薇葉總黃酮提取將紫薇葉洗凈烘干，粉碎，過20目篩，精確稱取紫薇葉粉末10 g，加100 ml 95%乙醇，超聲波提取2. 0 h，抽濾。濾渣再加100 ml 95%乙醇，超

6、聲波繼續(xù)提取 2. 0 h，抽濾，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩20 ml左右為止，置250ml 容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，即得樣品液。2定性實(shí)驗(yàn)-總黃酮的鑒別2.2.1氨顯色反應(yīng)將紫薇黃酮提取物溶液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，觀察顏色變化。 2.2.2鋁鹽反應(yīng)向向紫薇黃酮提取物溶液中加入1 %三氯化鋁溶液，觀察顏色變化，在300 800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定色素溶液加入三氯化鋁溶液后的吸光度。2.2.3鐵鹽反應(yīng)向紫薇黃酮提取物溶液中滴加醋酸鉛和氯化鐵水溶液，觀察顏色變化。2.2.4碳酸鈉反應(yīng)向黃酮提取物溶液中加入碳酸鈉，觀察顏色變化。2. 3測(cè)定方法以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定苦竹葉中

7、總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)控制適 宜pH值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收 峰。2. 4定量實(shí)驗(yàn)-總黃酮的含量測(cè)定2. 4. 1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇精確量取一定量的樣品液，在堿性條件下，加入0.30 ml 5%亞硝酸鈉溶液， 經(jīng)硝酸鋁顯色后，以試劑為空白參比液，在420-700 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定絡(luò)合物的 吸光度，結(jié)果表明絡(luò)合物在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰出現(xiàn)，故測(cè)定時(shí)選用此波 長(zhǎng)為特征吸收峰位置。2. 4. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表1紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蘆丁對(duì)照液吸光度蘆丁濃度。/mg-ml-1吸光度0.000.0000.010.1200.020.2720.03

8、0.4450.040.5270.050.824精密稱取蘆丁20 mg，加60%乙醇水溶液定容至100 ml，從中取出25 ml并且 用蒸餾水稀釋至50 ml。再分別吸取0. 00，1. 00，2. 00，3. 00，4. 00，5. 00 ml于 10. 00 ml具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0. 30 ml，搖勻，靜置6 min ；再 加10%硝酸鋁水溶液0. 30 ml，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉水溶液4. 00ml,用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15min后，以試劑為空白，在510 nm 處測(cè)吸光度。結(jié)果見表1。根據(jù)表1可得蘆丁濃度(C )與其吸光度(A)具有良好

9、的線性關(guān)系，結(jié)果見圖1。標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程式為：A=14.50C0.012. 4. 3樣品含量測(cè)定分別精確吸取提取液5 mL于3個(gè)50 mL容量瓶中，加入5 %NaNO2溶液1.6 mL，搖勻，放置6 min后加入10 %Al(NO3)3溶液1.6 mL，搖勻，放置6 min，再 加4 % NaOH溶液20 mL，搖勻，顯色，以蒸餾水定容至刻度，放置15 min后于 510 nm處測(cè)吸光度(以不加蘆丁的空白管為對(duì)照調(diào)零)A，A2，A3，根據(jù)回歸方 程：A=，計(jì)算出黃酮含量，計(jì)算紫薇葉總黃酮含量的平均值C= 0. 292mg/ml。2. 4. 4回收率實(shí)驗(yàn)精密量取

10、樣品液2. 00 ml,加入標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對(duì)照品2. 00 ml (0. 125 mg/ml)，同前 樣品測(cè)定方法操作測(cè)定吸光度，求得的回收率為100. 5%。2. 5紫薇葉黃酮對(duì)OH的清除作用參照Fenton反應(yīng)的方法建立OH.自由基產(chǎn)生體系模型凹。H2O2與二價(jià)鐵離子 混合后產(chǎn)生OH的Fenton反應(yīng)為：H2O2+ Fe2+=OH-+OH+Fe3+，OH具有很高的反 應(yīng)活性，存活時(shí)間短，但在反應(yīng)體系中加入鄰二氮菲，能有效地捕捉OH并產(chǎn)生 有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在536 nm處有強(qiáng)吸收，若加入具有清除OH功能的被測(cè)物，但 會(huì)與鄰二氮菲競(jìng)爭(zhēng)OH.，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。采用固定反應(yīng)時(shí)間法， 在536

11、 nm處測(cè)量含被測(cè)物反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較，便能測(cè)定被測(cè)物對(duì) OH的清除作用。一 取7支具塞試管，分別加入0.75 mmol L-1鄰二氮菲溶液1 mL； pH7.4的PBS 緩沖液3.8 mL，充分混勻后再加0.75 mmol L-1 FeSO4溶液1. 5 mL立即混勻。然后 向其中5支試管分別加入0.4, 0.8，1.2，1.6, 2.0 ml的黃酮溶液，混勻。另2支分 別為損傷和未損傷管，不加黃酮溶液，在損傷管中加入0.01 %H2O2 1 mL，未損 傷管不加H2O2，最后用蒸餾水補(bǔ)至相同體積10 mL，6支試管于37 。保溫1 h，測(cè) a536。計(jì)算OH清除率。OH清除率=

12、(A2- A1) / ( A0-A1) X 100 %其中A0表示未損傷管的吸光度，A1表示損傷管的吸光度，A2表示加黃酮溶液 的吸光度。3結(jié)果與討論1黃酮類物質(zhì)定性鑒定結(jié)果3.1.1氨顯色反應(yīng)將紫薇葉乙醇提取液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，立刻產(chǎn)生深黃色， 當(dāng)濾紙放置久后，因氨的揮發(fā)而褪色，這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。3.1.2鋁鹽反應(yīng)向紫薇葉乙醇提取液中加入1 %三氯化鋁溶液，有一種黃色可溶性物質(zhì)生成， 可使溶液吸光度增大，說明有黃酮類物質(zhì)存在。3.1.3鐵鹽反應(yīng)向紫薇葉乙醇提取液中加入氯化鐵溶液后，生成了墨綠色的沉淀，放置一段 時(shí)間溶液的顏色基本褪去，這也是黃酮類物質(zhì)的典型反應(yīng)。3.1

13、. 4碳酸鈉反應(yīng)向紫薇葉乙醇提取液中加入碳酸鈉溶液后，出現(xiàn)灰綠色，表明有異黃酮存在。3. 2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立蘆丁質(zhì)量濃度C和吸光度A的關(guān)系，曲線的回歸方程為：A=14.50C0.01。說明本檢測(cè)方法中蘆丁濃度與吸光度有良好的相關(guān)性。3. 3黃酮類化合物含量測(cè)定按2. 4項(xiàng)下進(jìn)行紫薇葉中總黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定，結(jié)果為經(jīng)過超聲提取的 的紫薇葉中總黃酮類物質(zhì)平均含量為4.01%。3. 4紫薇葉對(duì)OH的清除作用按照2. 5的方法測(cè)定紫薇葉黃酮對(duì)O H的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。5 4 3 2 1 0 o o o o O鄙簸- HO圖2紫薇葉黃酮對(duì)O H的清除作用由圖2可以看出在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紫

14、薇葉黃酮對(duì)H2O2/Fe2+體系通過 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH具有清除作用，且紫薇葉黃酮清除OH.的能力隨著加入量 的增加而上升，即清除率與黃酮的用量存在著一定的量效關(guān)系，說明紫薇葉黃酮 對(duì)OH 活性有一定的清除作用。4討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取紫薇葉黃酮類物質(zhì)的方法，所得產(chǎn)品純度高， 回收率為72.01%。與常規(guī)乙醇提取法相比，超聲波可以強(qiáng)化乙醇浸提法，達(dá)到省 時(shí)、高效、節(jié)能的目的，而且新方法采用全物理過程，無任何污染，工藝過程簡(jiǎn) 單，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效 成分，具有很高的藥用價(jià)值。在

15、自然界中最常見的是黃酮醇和黃酮，其余結(jié)構(gòu)還 包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮 類等6。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障， 進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而表現(xiàn)出諸多功能，如消除疲勞、保護(hù)血管、防止動(dòng)脈硬化、 擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細(xì)胞等 等。因此黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào) 節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等功效11， 12。近年來，世界各地掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)備 受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目，紫薇葉分布廣泛。本文 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅葉中不僅含有豐富的黃酮類化合物，而且其內(nèi)含的黃酮物質(zhì) 對(duì)羥自由基具有很好的清除能力。因此，紫薇葉具有廣泛開發(fā)和利用價(jià)值，值得 加強(qiáng)資源開發(fā)