免疫共沉淀原理及注意事項(xiàng)

1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)單系金-實(shí)驗(yàn)原理以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基萬(wàn)船勺用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法?？剐菁t細(xì)胞抗體是兌疫系統(tǒng)A外界抗販的剌激F產(chǎn)生的科蛋白如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合藥蛋白頂Y也能沉淀下乗。Y-X-抗X問(wèn)題：細(xì)胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？褲/VDAJVLCO-IP應(yīng)用與IP區(qū)別測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔co-ip與ip只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）1.提取蛋白2

2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體3孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead_t)若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物:YX抗X抗體ProteinA或Gn3經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。(xy抗原、x抗體)agarosebead瓊月旨糖珠proteinA/G有一個(gè)很重要的特性就是能與抗體的Fc段結(jié)合COJP原理圖解細(xì)胞褻解物或蛋白混合極和偶聯(lián)有抗純的臟一起斬有J偶聯(lián)的抗體亠抗廊離心井詵滌j7丁r洗脫3訶與紬:區(qū)反應(yīng)的蛋白proteinA/G-瓊脂糖珠復(fù)合物ProteinA是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）的F

3、c區(qū)結(jié)合。目前多用proteinA/G預(yù)先結(jié)合在argarosebeads上。ProtelnA/G的作用及具體原理“捕獲”抗體，形成復(fù)合物,抗體-目的蛋白-ProteinA/Gbeads非共價(jià)健結(jié)合ProteinA/G-garosebeads加樣緩沖液-煮沸變性-離心共價(jià)結(jié)合ProteinA/GbeadsEP管（抗體-目的蛋白-少量非特異性吸附蛋門）。二COIP特征優(yōu)點(diǎn)(1相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)(2蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響(3可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物二COJP特征局限性(1可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用

4、(2兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用;(3必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)提取細(xì)胞總蛋白11離心/上清電泳（抗原抗體）三實(shí)驗(yàn)流程準(zhǔn)備PA珠子，PBS洗3遍IPA珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景）I離心去PA珠子,取上清I測(cè)蛋白濃度（BCA法）I加一抗反應(yīng)（4C過(guò)夜）I加PA珠子捕捉復(fù)合物（室溫lh或代過(guò)夜）離心，收集沉淀，預(yù);令RIPABuffer洗3遍I上樣緩沖液懸浮沉淀,加熱游離抗原.抗體.珠子四實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析SDSWesternblotting分析:質(zhì)譜分析檢測(cè)目的蛋白SDS結(jié)果分析(a)(b)Myosin

5、0-GalactosidaseGlycogenphosphorylasebBovineserumalbuminOvalbuminCarbonicanhydraseSoybeantrypsininhibitorLysozyme12標(biāo)難曲線只對(duì)同相對(duì)遷移率=蛋白樣品距加樣端遷移距離5）漠酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離（cm）以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可汎J出其分于量。一塊凝月交上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。WB結(jié)果分析ECL試劑SUBSTRATE二抗（辣根酶標(biāo)記的羊抗兔igG）轉(zhuǎn)印膜上蛋白檢測(cè)示意圖COIP與質(zhì)譜分析流程肽質(zhì)譜指紋圖酶解上樣與洗滌

6、色譜垃料洗脫W丿出冑?gòu)剑?H）流出液（5001000nl）鈉升級(jí)電噴霧離了化毛細(xì)管數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)鑒定注釋三實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵1-實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。2.為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。4.確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。？注意的問(wèn)題：1裂解液III細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)諭內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用，

7、多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS）,細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktaileroRIPA裂解液普利萊基因技術(shù)有限公司100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.(100元)說(shuō)明：1裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為lmM的PMSF或其它蛋白酶抑制劑。2.RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法測(cè)定蛋白濃度裂解液成分國(guó)內(nèi)博士：細(xì)胞裂解液：

8、50mMTris-HC（lpH7.5）,150mMNaCl,0.5%NP-40,lmMEDTA使用前加入PMSF至終濃度ImM、proteinaseinhibitorcockta訂（混合物）。劉巖BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween2021免疫沉淀中抗體的選擇參克隆抗體單克隆坑體單克隆抗體群（由f免痕原產(chǎn)生的勢(shì)個(gè)單克隆抗體混合物）抗體抗原作用扱佳亡抗依的肖口力決走（殽隹或者取弱）極佳11常很妊隹有時(shí)會(huì)有三三持驢性用互作走視哇，彳巨有時(shí)會(huì)有乂叉反應(yīng)極佳（曰=淸可處行

9、IP且浸有交叉反應(yīng)的抗沫組如克崖抗碎）優(yōu)點(diǎn)親和力言（主于抗恬可以與目的蚩二的家個(gè)抗原決走簇吋互作屋特異性F.三可麻琨量供應(yīng)持異性好.親力高（曰三選掛可涯亡IF耳殳每交叉註的抗雄且成呈亮隆抗擄）缺忌三三樣冥性唔互作定艱進(jìn)去除幕要雋送寺口力盲的抗燒：:抗底表泣可館會(huì)枝相互詐冃呈=能竣篇選得到迫符合條件世呈売隆井穴妄所以里克圄亢體牡就7落易歸鬼疫沉淀效果極僅（由于親mtl高）主抗龍:的奇口力決走（換哇或君更弱）板佳（曰丁選攔可心迭&尸巨妥有交叉反應(yīng)昴抗曲且衣羊売隆抗沐竽）免疫共沉淀效果遷常很妊.址有時(shí)2持貝炷弓互作至?xí)纴?lái)假陽(yáng)性主抗館:的奇口力決走和抗底表垃是吞戎相互詐巨蛋e適蔽決走（換哇或看極弱）

10、極佳曰=粋可以耘送行IF巨浸有卻艮應(yīng)旳抗體迫舞芫隆抗碎）瀆色淺免疫藥7果逵常很好佢有時(shí)三三持驢性月互作弔會(huì)帶來(lái)假陽(yáng)性主抗徒的茅口力決二和抗原表忙層召氓遠(yuǎn)菽或君以及彳亢辰表位是舌樂(lè)交聯(lián)實(shí)趁所藪環(huán)決走（菽隹或著氐弱）極佳（曰亍選擇可哄磁送疔尸巨沒(méi)有交叉艮應(yīng)筆抗沌組咸笛芫隆扔碎）注意的問(wèn)題：22抗體使用對(duì)照抗體：（陰性和陽(yáng)性）陰性：?jiǎn)慰寺】贵w：同一種屬的IgG兔多克隆抗體：正常兔IgG陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A,用膜蛋白B）未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少可能原因處理方法1樣品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4弋以下冰上操作并防止凍融2抗體濃度太低:調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度3抗抗體親合力太低:選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體4.IP抗體未與agarose珠子結(jié)合：選用適合于IP的相應(yīng)珠子,正確保存防止變質(zhì)或干燥5.Tag未罪露在融合蛋白構(gòu)象的表面：改變tag融合表達(dá)部位6裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高:改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液目得蛋白高背景:可能原因處理方法非特異蛋白結(jié)合在無(wú)血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；在免疫沉淀前用protein（G/A）珠子預(yù)洗，免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染轉(zhuǎn)移膜上的非