基因工程基因工程概述課件

1、第二章 基因工程第一節(jié) 基因工程概述一、基因工程的含義按照人們的愿望，進行嚴密的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在較短的時間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新的生物類型，這就是基因工程的基本含義。 第一節(jié) 基因工程概述二、基因工程研究的理論依據(jù)（一）不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)（二）基因是可以切割的（三）基因是可以轉(zhuǎn)移的（四）多肽與基因之間存在對應關(guān)系（五）遺傳密碼是通用的（六）基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代第一節(jié) 基因工程概述三、基因工程操作的基本技術(shù)路線第一節(jié) 基因工程概述四、基因工程研究最突出的優(yōu)點打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限，可以使原核生物與真核

2、生物之間、動物與植物之間，甚至人與其他生物之間的遺傳信息進行相互重組和轉(zhuǎn)移。人的基因可以轉(zhuǎn)移到大腸桿菌（E.coli）中表達，細菌的基因可以轉(zhuǎn)移到動植物中表達。第二節(jié) DNA重組一、DNA概述（一）DNA的組成和結(jié)構(gòu)雙鏈DNA示意圖 第一節(jié) 基因工程概述終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)模式 一、DNA概述（二）DNA的功能1. DNA分子能在細胞內(nèi)復制2.攜帶遺傳信息第二節(jié) DNA重組二、目的DNA片段的獲得（一）限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化1. 限制性內(nèi)切核酸酶2. 限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列3. 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點4. 限制性內(nèi)切核酸酶反應系統(tǒng)5.用限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA的方法限制性內(nèi)切核酸酶

3、酶切DNA的位點和酶切片段的末端 DNA酶切片段電泳示意圖 第二節(jié) DNA重組二、目的DNA片段的獲得（二）特異性DNA片段的PCR擴增1.PCR基本原理2.耐熱性DNA聚合酶3.PCR引物4.DNA片段PCR擴增系統(tǒng) PCR擴增特異性DNA片段過程 第二節(jié) DNA重組二、目的DNA片段的獲得（三）DNA片段的化學合成1.合成引物2.合成DNA寡核苷酸連桿3.合成基因片段第二節(jié) DNA重組三、DNA片段的連接（一）DNA連接酶（二）DNA片段之間的連接1. 互補黏性末端片段之間的連接2.平末端DNA片段之間的連接3.DNA片段末端修飾后進行連接4. DNA片段加連桿或銜接頭后連接第二節(jié) DNA

4、重組三、DNA片段的連接（三）DNA重組類型1.插入重組2.置換重組第三節(jié) 基因克隆載體一、質(zhì)粒載體（一）大腸桿菌質(zhì)粒載體第三節(jié) 基因克隆載體一、質(zhì)粒載體（二）藍藻和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體第三節(jié) 基因克隆載體一、質(zhì)粒載體（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體（四）酵母2m質(zhì)粒載體用于植物轉(zhuǎn)基因的克隆載體示意圖 第三節(jié) 基因克隆載體二、病毒（噬菌體）克隆載體（一）噬菌體克隆載體1.噬菌體克隆載體第三節(jié) 基因克隆載體二、病毒（噬菌體）克隆載體（一）噬菌體克隆載體2.cosmid載體第三節(jié) 基因克隆載體二、病毒（噬菌體）克隆載體（二）植物病毒克隆載體35S啟動子表達載體示意圖 第三節(jié) 基因克隆載體二、病毒（噬菌體）

5、克隆載體（三）動物病毒克隆載體 痘苗病毒載體示意圖 第三節(jié) 基因克隆載體三、人工染色體載體大片段克隆載體 HAC構(gòu)建示意圖第三節(jié) 基因克隆載體三、人工染色體載體大片段克隆載體第三節(jié) 基因克隆載體四、體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）（一）常規(guī)基因定位整合系統(tǒng)第三節(jié) 基因克隆載體四、體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）（二）基于噬菌體P1的CreLox定位重組系統(tǒng) Cre介導幾種可能發(fā)生的重組方式P:啟動子； ：loxp；a、b、c、d、e、f、g、h：相關(guān)基因第四節(jié) 目的基因的制備一、目的基因的來源目的基因主要來源于各種生物。真核生物染色體基因組，特別是人和動植物染色體中蘊藏著大量的基因，是獲得目的基因的主

6、要來源原核生物的染色體基因組也是目的基因來源的候選者 質(zhì)?；蚪M、病毒（噬菌體）基因組、線粒體基因組和葉綠體基因組也有少量的基因 第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑（一）利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離目的基因第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑（二）利用PCR直接擴增目的基因第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑（三）目的基因的化學合成第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑（四）通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因1.基因組文庫第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑2.cDNA文庫第四節(jié) 目的基因的制備二、分離目的基因的途徑3.從基因組文庫或cD

7、NA文庫中獲得目的基因第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞一、受體細胞（一）原核生物細胞（二）真核生物細胞第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞二、重組DNA分子導入受體細胞（一）外源DNA轉(zhuǎn)化方法化合物誘導轉(zhuǎn)化法 致癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 電穿孔轉(zhuǎn)化法微彈轟擊轉(zhuǎn)化法 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 超聲波處理轉(zhuǎn)化法 脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法 體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法 花粉管通道轉(zhuǎn)化法 精子介導法 低能離子束介導轉(zhuǎn)化法 第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞二、重組DNA分子導入受體細胞（二）病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導法用病毒（噬菌體）的DNA（或RT-DNA）構(gòu)建的克隆載體（或攜帶目的基因），在體外包裝成病毒（噬菌體）顆粒后，感染受體細胞，使

8、其攜帶的重組DNA進入受體細胞。將此過程稱為病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導（transduction）法,主要用于構(gòu)建基因文庫和動物的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞三、克隆子的篩選（一）根據(jù)載體標記基因篩選轉(zhuǎn)化子1.根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞三、克隆子的篩選（一）根據(jù)載體標記基因篩選轉(zhuǎn)化子2根據(jù)載體除草劑抗性基因和相應的性質(zhì)藥物篩選轉(zhuǎn)化子3.根據(jù)lacZ基因互補顯色篩選轉(zhuǎn)化子4.根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補篩選轉(zhuǎn)化子5.根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補篩選轉(zhuǎn)化子第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細胞三、克隆子的篩選（二）

9、根據(jù)報道基因篩選重組子1. -葡萄糖酸苷酶基因（gus）2.螢火蟲熒光素酶基因(luc)3.綠色熒光蛋白基因（gfp） （三）根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子第六節(jié) 重組子的鑒定一、根據(jù)重組DNA分子特征鑒定重組子（一）根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子（二）根據(jù)重組DNA分子限制性內(nèi)切核酸酶酶切圖譜鑒定重組子（三）根據(jù)PCR擴增片段鑒定重組子（四）采用DNA雜交法鑒定重組子（五）應用DNA芯片鑒定重組子（六）根據(jù)DNA核苷酸序列鑒定重組子第六節(jié) 重組子的鑒定二、根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA鑒定重組子三、根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)（酶）、多肽鑒定重組子（一）蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定重組子（二）免疫檢測法鑒定

10、重組子1.酶聯(lián)免疫吸附法2. Western印跡法3.質(zhì)譜分析法第七節(jié) 基因工程的應用和安全性問題一、基因工程的應用二、基因工程的安全性問題植物基因組DNA的提取一、實驗目的理解提取基因組DNA的原理，學習植物基因組DNA的提取方法。 植物基因組DNA的提取二、實驗原理利用基因組DNA較長的特性，可以將其與細胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞。在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨。離子型表面活性劑，能夠使DNA得以游離出來。苯酚和氯仿能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，經(jīng)離心后除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。無水乙醇使DNA沉淀，大

11、分子DNA沉淀形成纖維狀絮團漂浮其中，用玻棒取出，小分子DNA形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達到提取的目的。絮狀DNA沉淀溶于TE溶液中，即得植物基因組DNA溶液。植物基因組DNA的提取三、實驗儀器高速冷凍離心機，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，恒溫搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，低溫冰箱，制冰機，高壓滅菌鍋。實驗試劑與用品：TrisCl，EDTA，NaCl，KAc，SDS，RNA酶A，氯仿，異丙醇，無水乙醇，TE，ddH2O植物基因組DNA的提取四、實驗步驟1.取幼嫩的組織材料1g，用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500L提取液的離心管中，每個離心管加入0.1g，輕輕混勻。2.向管中加入50L20% SDS溶液，混勻，不可過于強烈震蕩以防基因組DNA斷裂，65保溫10min，并不時搖動。3.加入50L5molLKAc，混勻，置冰上2030min.4.4，15000rmin離心15min，轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，加入0.7倍體積的異丙醇，混勻，-20沉淀30min。植物基因組DNA的提取四、實驗步驟5. 12000rmin離心10min回收基因組DNA沉淀，