酶工程重點(diǎn)背

1、1、問答：為什么說酶活性部位的柔性是其充分表現(xiàn)活性所必需的？答：1）、誘導(dǎo)契合：滿足底物結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，以使酶活性部位的活性基團(tuán)形成一定的空間取向，從而保 持一個(gè)適應(yīng)催化反應(yīng)的空間微環(huán)境；2）、殘基側(cè)鏈活性基團(tuán)的運(yùn)動(dòng)更加有利于酶催化的高效性；3）、很多酶的催化效率和底物專一性都受其他因素調(diào)節(jié)，這就要求酶的活性部位保持一定的柔性，使其 局部環(huán)境受調(diào)節(jié)因素影響后能發(fā)生細(xì)微構(gòu)象變化，從而調(diào)節(jié)酶的活性和底物專一性。2、問答：辯證談“酶的柔性和剛性是局部的，也是相對(duì)的”。答：1）、對(duì)于局部柔性部位必須要由其剛性部分來支持；2）、酶分子既要有相對(duì)穩(wěn)定的整體結(jié)構(gòu)，又要有相對(duì)柔性的微環(huán)境狀態(tài)。正是這種剛?cè)?/p>

2、相濟(jì)的獨(dú)特酶分子 結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了酶催化反應(yīng)高效性和可調(diào)節(jié)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。3、問答：如何理解“Km可了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平”？答：由Km的式子（列出），一般來說作為酶的最適底物，其在體內(nèi)的濃度水平應(yīng)接近于它的Km值。1）、若體內(nèi)S0 Km，則V Vmax，說明大部分的酶在體內(nèi)是不起作用的，處于一種浪費(fèi)的狀態(tài);2）、若體內(nèi)S0 Km，則VVmax，這種底物濃度會(huì)失去生理意義，也不符合實(shí)際。4、區(qū)別可逆抑制和不可逆抑制作用的動(dòng)力學(xué)方法:1）、方案一：當(dāng)混合液加入底物時(shí)，對(duì)3而言，相當(dāng)于將酶和抑制劑均稀釋了，取出的混合液體積越小其被稀釋的倍數(shù) 也就越大，體系中抑制劑的濃度也就越小，相應(yīng)的抑制作用

3、就越弱。（2-不可逆抑制劑僅降低酶濃度）2）、方案二：固定反應(yīng)體系體積，加入一定量抑制劑一一加不同濃度的酶一一測酶活。未加抑制劑加入不可逆抑制劑OE加入可逆抑制劑OE初速度對(duì)酶濃度作圖，對(duì)2而言，當(dāng)加入的是一定量不可逆抑制劑，那么一定量酶失活，只有加入的酶量 大于不可逆抑制劑的量時(shí)才能表現(xiàn)出酶活力；對(duì)3而言，加入可逆抑制劑只是降低了反應(yīng)速率，得斜率降低的 直線。（記：體積同，抑制劑量同，酶濃度不同）3）、方案三：固定反應(yīng)體積，加入不同濃度的抑制劑測定不同酶濃度下的酶活。（體積同，濃度均不同）V f/ 1 P TOC o 1-5 h z （a） -可逆抑制劑作用/ /（b） -不可逆抑制劑作用/

4、,/EE1（a）（b）對(duì)可逆抑制劑，抑制劑濃度增加時(shí)（箭頭向下），酶濃度增加，反應(yīng)速度仍呈直線緩慢增加；對(duì)不可逆抑 制，抑制劑濃度增加（向右），酶濃度要超越抑制劑濃度后才表現(xiàn)出活性，故直線斜率相同，向右移動(dòng)。丙二酸抑制琥珀酸脫氫酶：可逆競爭性抑制；琥珀酸抑制琥珀酸脫氫酶：底物抑制。5、可逆抑制作用：抑制作用類型KmVmax能否用增大底 物濃度的辦法 消除抑制作用雙倒數(shù)圖的特點(diǎn)競爭性抑 制增大不變能交于縱軸上的一點(diǎn)（1/Vmax）線性非競爭性抑制不變變小否交于橫軸上的_點(diǎn)（-1/Km）反競爭性抑制變小變小否一組平行線6、問答：別構(gòu)酶的生理調(diào)節(jié)功能是什么？答：分為正協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)：1）、正協(xié)

5、同效應(yīng)：可以使反應(yīng)底物的濃度在很窄的范圍內(nèi)即快速而大量地合成產(chǎn)物，并能調(diào)節(jié)參與幾個(gè)不 同代謝途徑的底物，使之在各個(gè)代謝途徑中得到合理分配；2）、負(fù)協(xié)同效應(yīng)：使酶促反應(yīng)對(duì)配體濃度相對(duì)不敏感，從而得以保證代謝中某條重要途徑能夠較為穩(wěn)定的 進(jìn)行下去；總之，別構(gòu)調(diào)節(jié)是快速影響酶活力的一種重要方式，受到別構(gòu)調(diào)節(jié)的酶通常處于代謝途徑的起始點(diǎn)或者分 叉點(diǎn)，也可能處于代謝途徑中的關(guān)鍵位點(diǎn)或者限速位點(diǎn)上，在體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)中有很重要的作用。7、通過延長10- 23核酶的結(jié)合臂的長度，將會(huì)對(duì)該酶催化底物反應(yīng)的Km和Kcat產(chǎn)生什么影響？答：脫氧核酶（deoxyribozyme,DNAzyme/Dz），不同催化活性的

6、Dz具有不同的結(jié)構(gòu)，但基本上都由催化部位和臂 構(gòu)成。底物序列改變，只要酶的底物結(jié)合臂以互補(bǔ)的方式改變并不會(huì)影響，其中要注意保持酶與底物的配對(duì)方 式。如果延長結(jié)合臂后酶與底物親和性增加，Km減小，Kcat因轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)而變大（問！）。iii 111111 In ihii 1131 J R 57* G TOC o 1-5 h z !GcATA；10-23仁心酉 （ref. 29）8、酶的固定化包括：1）、空間障礙：使得其他大分子難以與酶接近和作用，可以防止蛋白水解酶和蛋白抑制劑的作用，也可以防 止化學(xué)失活；2）、分配或擴(kuò)散限制：酶被固定化后，尤其是在包埋法固定時(shí)，底物必須先擴(kuò)散到載體表面，然后才能

7、進(jìn)入 內(nèi)部與酶作用，此時(shí)由于擴(kuò)散限制使得反應(yīng)速度對(duì)酶濃度的依賴性較弱而對(duì)底物的獲得依賴性較強(qiáng)，酶的“穩(wěn) 定化”程度增加；3）、抑制酶的自降解：固定化后可使酶的構(gòu)象更加牢固，能阻止酶從折疊態(tài)到伸展態(tài)的過渡。9、為什么溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可？1）、浪費(fèi);2）、高溶氧速率會(huì)抑制某些酶，如青霉素?；傅暮铣?；3）、為獲得高溶解氧速率而采用的大量通氣或快速攪拌等措施會(huì)對(duì)某些細(xì)胞造成損害。所以，溶解氧速率應(yīng)該等于或稍高于耗氧速率，耗氧速率=細(xì)胞呼吸強(qiáng)度x細(xì)胞濃度。10、問答：為什么說延續(xù)和成型是酶工業(yè)生產(chǎn)中最理想的合成模式？答：屬于這一類型的酶在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的差別，細(xì)胞開始生長便

8、有酶的產(chǎn)生，直到生長進(jìn)入 平臺(tái)期后，酶還可以繼續(xù)產(chǎn)生一段較長的時(shí)間。11、發(fā)酵液預(yù)處理的目的是什么？1）、改變懸浮液中固體離子的物理特性，如提高硬度、加大顆粒尺寸、改變表面類型等；2）、使某些可溶的膠黏物質(zhì)變?yōu)椴豢扇埽?）、改變液體的某些物理性質(zhì)，如降低粘度和密度；4）、產(chǎn)胞內(nèi)酶的細(xì)胞還需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以使其胞內(nèi)酶能最大限度地釋放?？傊A(yù)處理的目的就是要使發(fā)酵液中的酶易于通過分離、過濾而與發(fā)酵液中的其他成分分開。12、SDS的原理是什么？答：SDS:斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使之去折疊；強(qiáng)還原劑：使二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑，蛋白質(zhì)分子被解聚，解聚后的AA側(cè)鏈與SDS充分

9、結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋 白質(zhì)-SDS膠束，其所帶負(fù)電荷大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了分子間原有的電荷差異。蛋白 質(zhì)-SDS膠束在水溶液中的形狀像一個(gè)長的橢圓棒，棒的短軸對(duì)不同蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上相同，長軸的 長度則與蛋白質(zhì)亞基分子量的大小成正比。所以這種膠束在SDS凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受分子本 身電荷量的影響，而主要取決于橢圓棒長軸的長度也即是蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小。13、為什么說目前獲得的核酶、脫氧核酶與蛋白類酶在催化類型和活力上都相差甚遠(yuǎn)?答：1）、就蛋白質(zhì)和核酸本身的化學(xué)組成來看，蛋白質(zhì)更具催化潛能；2）、目前核酶、脫氧核酶很多結(jié)構(gòu)和功能還遠(yuǎn)未被開發(fā)；3）、目前

10、的體外選擇無論在時(shí)間還是空間上都有限。14、培養(yǎng)基配制中，碳源的選擇原則：對(duì)酶生物合成的調(diào)節(jié)作用。1）、誘導(dǎo)作用：乳糖、IPTG （乳糖類似物）誘導(dǎo)8 -半乳糖苷酶合成；纖維二糖（纖維素酶催化反應(yīng)產(chǎn)物）誘 導(dǎo)纖維素酶合成；2）、分解代謝物阻遏作用：葡糖糖阻遏8 -半乳糖苷酶合成（利用碳源分解代謝的產(chǎn)物阻遏酶的生物合成，主 要針對(duì)誘導(dǎo)酶；3）、反饋?zhàn)瓒糇饔茫寒a(chǎn)物阻遏，反饋抑制。15、問答：對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾的目的為什么？答：1）、研究酶的結(jié)構(gòu)與功能：化學(xué)修飾酶分子功能基團(tuán)，測定酶活改變以確定氨基酸殘基的功能、某一氨基 酸的數(shù)量、酶的空間結(jié)構(gòu)；2）、增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性：酶熱失活是酶分子的

11、天然構(gòu)象向熱力學(xué)上熵值增高的方向變化， 即從緊密有序趨于隨即松散，去折疊，最終喪失催化功能。酶化學(xué)修飾從增強(qiáng)天然酶構(gòu)象的穩(wěn)定性著手來減少 酶熱失活。酶與修飾劑交聯(lián)后可使之天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，同時(shí)減少分子內(nèi)部的熱振動(dòng)以增 強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。3）、保護(hù)酶的活性部位與抗抑制劑：阻斷酶抑制劑與酶結(jié)合。酶經(jīng)化學(xué)修飾共價(jià)交聯(lián)上大分子修飾劑后， 修飾劑產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力可有效阻擋抑制劑對(duì)酶的進(jìn)攻，并“遮蓋”酶的活性部位，增加抑制劑與酶 結(jié)合的難度，抗抑制劑能力增強(qiáng)。4）、維持酶結(jié)構(gòu)功能的完整性與抗蛋白水解酶：蛋白水解酶一般作用于敏感鍵以斷裂多肽鏈。酶分子交聯(lián) 上大分子修飾劑后，由空間障礙

12、作用能阻擋蛋白水解酶接近酶分子，并“遮蓋”敏感鍵。同時(shí)酶分子上的敏感 基團(tuán)大多參與修飾反應(yīng)，減少受蛋白水解酶破壞的可能性。5）、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境：酶的化學(xué)修飾使組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成共價(jià)鍵，從 而降低或消除酶的抗原性。大分子修飾劑也能“遮蓋”抗原決定簇以阻礙結(jié)合反應(yīng)；維持微環(huán)境的平衡被破壞， 酶分子伸展，故經(jīng)化學(xué)修飾一方面能減少由內(nèi)部平衡力破壞而引起的酶分子伸展，另一方面可在酶分子表面形 成一層“緩沖外殼”，一定程度上抵御外界環(huán)境的電荷、極性作用，維持微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。一些概念：1、模擬酶（人工酶0酶模型）：分子水平-模擬-酶結(jié)構(gòu)特征（活性部位大小、性狀、微環(huán)境等）、作用

13、機(jī) 理、立體化學(xué)等特性。（分子水平模擬生物功能）2、酶：生物催化劑，具生物催化功能的生物大分子，生物體產(chǎn)生，在體內(nèi)外均有活性。3、1896年，由Buchner兄弟首先發(fā)現(xiàn)，其用石英砂磨碎酵母細(xì)胞或無細(xì)胞濾液均能和酵母細(xì)胞一樣進(jìn)行 酒精發(fā)酵，標(biāo)志著酶學(xué)研究的開始。4、現(xiàn)狀：目前大規(guī)模利用和生產(chǎn)的商品酶還很少。中英文對(duì)照：extraction separation 萃取分離feedback inhibition 反饋抑制feedback repression反饋?zhàn)瓒糇饔胒ermentation 發(fā)酵fermentation kinetics 發(fā)酵動(dòng)力fermentation production

14、發(fā)酵生產(chǎn)filtration 過濾gel electrophoresis 凝膠電泳gel filtration 凝膠過濾general acid-base catalysis 廣義酸堿催化ground state 基態(tài)hammerhead structure 錘頭結(jié)構(gòu)high speed centrifuge 高速離心機(jī)holoenzyme 全酶host-guest chemistry 主-客體化學(xué)hydrogen bond 氫鍵hydrophobic interaction 疏水相互作用hydrolase水解酶hydrophobic chromatography 疏水層析immobiliza

15、tion 固定化*immobilization method 固定化方法immobilized cell固定化細(xì)胞immobilized enzyme 固定化酶immobilized protoplast固定化原生質(zhì)體immune affinity chromatography 免疫親和層析induced fit hypothesis 誘導(dǎo)契合學(xué)說inducer誘導(dǎo)物inorganic salt 無機(jī)鹽intervening sequence 間隔序歹0ion exchange chromatography 離子交換層析ionic bond 鹽鍵irreversible inhibition

16、不可逆抑制irreversible inhibitor 不可逆抑制劑isoelectric focusing 等電聚焦isoelectric point 等電點(diǎn)isoelectric precipitation 等電點(diǎn)沉淀isoenzyme同工酶isomerase異構(gòu)酶lectin affinity chromatography 凝集素親和層析ligase連接酶lock and key theory 鎖鑰學(xué)說low speed centrifuge 低速離心機(jī)lyase水解酶main chain modification 主鏈修飾mass spectrometry 質(zhì)譜分析membrane s

17、eparation technology 膜分離技術(shù)metabolite repression分解代謝物阻遏作用metal ion affinity chromatography 金屬離子親和層析metal ion substitute modification 金屬離子置換修飾Michaelis constant 米氏常數(shù)mimic enzyme 模擬酶molar catalytic activity 摩爾催化活性molecular chaperone 分子伴侶molecular engineering of the enzyme 酶的分子工程molecular imprinting 分子印

18、記multifunction ribozyme 多功能核酶multienzyme complex 多酶復(fù)合體multienzyme conjugate 多酶融合體native structure 天然結(jié)構(gòu)absolute specificity 絕對(duì)專一性absorption chromatography 吸附層析abzyme抗體酶activator激活劑active center活性中心active energy 活化能affinity chromatography 親和層析affinity modification 親和修飾allosteric enzyme 別構(gòu)酶allosteric e

19、ffector 別構(gòu)效應(yīng)物allosteric modulator 別構(gòu)調(diào)節(jié)物amino acid substitute modification 氨基酸置換修飾apoenzyme脫輔基酶apoprotein脫輔基蛋白auxiliary residue 輔助殘基binding energy 結(jié)合能biological catalyst 生物催化劑biosynthesis生物合成bond specificity 鍵專一性carbon source 碳源catalytic activity 催化活性catalytic antibody 催化性抗體cell growth kinetics細(xì)胞生長動(dòng)力

20、學(xué)centrifugal force 離心力centrifugal speed 離心速度centrifugation 離心centrifuge離心機(jī)，離心chromatofocusing 層析聚焦chromatography 層析coenzyme 輔酶cofactor輔因子competitive inhibition 競爭性抑制competitive inhibitor 競爭性抑制劑concentration 濃縮conformational change 構(gòu)象變化constitutive enzyme 組成酶contact residue 接觸殘基contributing residue 貢

21、獻(xiàn)殘基covalent affinity chromatography 共價(jià)親和層析covalent modification 共價(jià)修飾crystallization 結(jié)晶culture medium 培養(yǎng)基density gradient centrifugation 密度梯度離心deoxyribozyme 脫氧核酶differential centrifugation 差速離心double reciprocal plot 雙倒數(shù)作圖dye ligand affinity chromatography 染料-配體親和層析 electrophoresis 電泳energy barrier 能障

22、enzyme 酶enzyme activity 酶活性，酶活力enzyme application 酶的應(yīng)用enzyme biosynthesis酶的生物合成enzyme classification 酶的分類enzyme engineering 酶工程enzyme immobilization 酶的固定彳化enzyme molecule modification 酶分子修飾enzyme production 酶的生產(chǎn)enzyme production kinetics 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)equilibrium constant 平衡常數(shù)non-contributing residue 非貢獻(xiàn)殘基nu

23、clear magnetic resonance 核磁共振organic solvent precipitation 有機(jī)溶劑沉淀oxidoreductase氧化還原酶phosphatase 磷酸酶physical modification 物理修飾plant cell culture植物細(xì)胞培養(yǎng)polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝膠電泳precipitation 沉淀prosthetic group 輔基protein kinase 蛋白激酶purification 純化rate constant速度常數(shù)rate-limiting step 限速步驟reaction intermediate 反應(yīng)中間產(chǎn)物reactive oxygen species 活性氧regulatory enzyme 可調(diào)節(jié)酶relative centrifugal force 相對(duì)離心力relative specificity 相對(duì)專一性reverse osmosis 反滲透reversible inhibition 可逆抑制reversible inhibitor 可逆抑制劑reversible phosphorylation 可逆磷酸化rib