核酸的凝膠電泳

1、第四節(jié) 核酸的凝膠電泳Nucleic Acid Gel Electrophoresis1Content of Table 前 言一、 瓊脂糖凝膠電泳二、 聚丙烯酰胺凝膠電泳三、 脈沖場凝膠電泳2前 言 核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段； 優(yōu)點(diǎn)：（1）便于分離;（2）便于檢測;（3）便于回收： 3核酸凝膠電泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強(qiáng)度的電場中，它們會向正電極方向遷移；2）由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質(zhì)

2、粘度等的函數(shù)； 因此，可在同一凝膠中、一定電腸強(qiáng)度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。Home4一、 瓊脂糖凝膠電泳Agarose gel electrophoresis5（一）凝膠的制備及電泳6（二）DNA的遷移速率決定因素7 1 DNA分子的大小 雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比； 2 瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快； 8 3 DNA的構(gòu)象 一般同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀。 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。9 5 所用的電壓 低電壓時(shí)DNA片段遷移率

3、與所用的電壓成正比。 6 瓊脂糖種類 常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；10 不同類型瓊脂糖的性質(zhì)11不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍12 7 電泳緩沖液 常用的有TAE、TPE及TBE13TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較 都是常用電泳緩沖液。三者相比：1）TAE的緩沖容量最低，如長時(shí)間電泳會被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳

4、分辨率要好于TBE。 14（二） 凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。156凝膠載樣緩沖液類型6 緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)440% (m/V)蔗糖水溶液16（三）瓊脂糖凝

5、膠中DNA的檢測 通過染色, 紫外燈下檢測。 主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。171 凝膠的EB染色181920使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸21 （3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5 g/ml 。22（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。232 凝膠SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA

6、結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號。24（四） 凝膠中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。25（五） 凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收： 存在的主要問題：1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA Home26二、 聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE27 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈。 在雙功能交聯(lián)劑如N，N-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交

7、聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。 網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)28CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亞甲雙丙烯酰胺） 29（二） 聚丙烯酰胺凝膠電泳種類 1 變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈DNA片段的分離或純化。 變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。 用途：放射性DNA探針的分離、DNA測序反應(yīng)等。30 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈DNA片段的分離和純化。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：制備高純度的DNA片段。31（三）D

8、NA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍(lán)3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30; Home32三、 脈沖場凝膠電泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE33為何選PFGE？ 超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場強(qiáng)度。但 PEGE 解

9、決了這一問題。 34（一） PFGE 工作的基本原理 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。 該法可分離長至5Mb的DNA分子。嚴(yán)格說來，應(yīng)叫交替電場凝膠電泳。35B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖36（二）PEGE類型垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(vertical pulsed field)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(field inversion)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotating gel)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)(contour-clamped homogeneous electric field)37A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+38（三） 影響分辨率的因素1 脈沖時(shí)間（0.1s-1000s)：增加脈沖時(shí)間分離較大分子，減少脈沖時(shí)間分離較小分子。2 電壓：若固定脈沖時(shí)間，增加電場強(qiáng)度就增大了可分離最大片段的范圍，