學(xué)術(shù)干貨共聚焦顯微鏡中熒光團(tuán)的共定位

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)學(xué)術(shù)干貨：共聚焦顯微鏡中熒光團(tuán)的共定位在多標(biāo)熒光樣品圖像中，因兩個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)在顯微結(jié)構(gòu)中距離很近，經(jīng)常會(huì)有發(fā)射信號(hào)疊加，這種效應(yīng)就稱為共定位。目前，高特異性合成熒光團(tuán)和經(jīng)典免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用、精密光切技術(shù)的應(yīng)用、共聚焦和多光子顯微鏡提供的數(shù)字圖像處理技術(shù)等大大提高了生物樣品中共定位檢測(cè)的能力。圖 1共定位在生物表述上是這樣定義的：兩個(gè)或多個(gè)不同的分子位于樣品上同一個(gè)物理位置。對(duì)顯微鏡中看到的組織切片、單個(gè)細(xì)胞或亞細(xì)胞器官，共定位意味著不同的分子連接到同一個(gè)受體上；在數(shù)

2、字圖像方面，這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是不同熒光分子發(fā)射的顏色分享圖像中的同一個(gè)像素。在共聚焦顯微鏡中，樣品被記錄成含有很多像元的多維陣列數(shù)字圖像，每個(gè)像元代表一個(gè)三維像素。像元的尺寸（或檢測(cè)單元）由物鏡的數(shù)值孔徑、照明波長(zhǎng)以及共焦檢測(cè)針孔直徑等決定。因此，在一個(gè)樣品中兩個(gè)熒光探針的共定位，比如發(fā)綠光的 Alexa Fluor488，發(fā)橘紅色光的 Cy3，在圖像中就是由含有紅色和綠色兩者貢獻(xiàn)的像素表示（經(jīng)常產(chǎn)生各種各樣的橘色和黃色）。舉一個(gè)例子， 圖 1 的一系列圖表明了骨骼肌動(dòng)蛋白和黏著斑蛋白側(cè)向光學(xué)平面上的共定位（激光掃描共聚焦顯微鏡中的 XY 面）。這些共定位點(diǎn)可作為肌動(dòng)蛋白絲的成核位點(diǎn)，也可作為外部

3、介質(zhì)、質(zhì)膜和肌動(dòng)蛋白骨架之間的交聯(lián)劑。圖 1（ a）是 Alexa Fluor 568 通道（目標(biāo)對(duì)象是黏著斑蛋白），由 543nm 的氦氖激光器激發(fā)；而 Figure1（ b）是 Alexa Fluor488 通道(目標(biāo)對(duì)象是絲狀肌動(dòng)蛋白)，由 488nm 的氬離子激光器激發(fā)； Figure1（ c）是前面兩幅圖的疊加，表明兩種熒光信號(hào)在絲狀肌動(dòng)蛋白纖維末端的共定位。必須指出的是，共定位并不指的是具有相似發(fā)射光譜的熒光團(tuán)出現(xiàn)在合成圖像的同一個(gè)像素上。準(zhǔn)確的共定位分析只有在熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光譜足夠分離且濾色片（或光譜狹縫寬度）正確設(shè)置的情況下才有可能。熒光團(tuán)發(fā)射光譜之間的大量疊加或?yàn)V色片組合的

4、不正確使用，都可能導(dǎo)致光譜串色，這種情況下共定位的測(cè)量就沒(méi)有意義。為了避免產(chǎn)生共定位假象，熒光團(tuán)必須與照明光源的光譜認(rèn)真匹配（共聚焦中是激光線），來(lái)獲得最大激發(fā)效率，同時(shí)在發(fā)射光譜之間保持一定的分離度。在大多數(shù)情況下，對(duì)共定位分析來(lái)說(shuō)，熒光團(tuán)的選擇對(duì)獲得滿意結(jié)果極為重要。在圖 2 中，對(duì) Alexa Fluor 染料家族的光譜疊加作了比較，這在共定位實(shí)驗(yàn)中是很有用的。為了比較，所有的發(fā)射光譜都做了歸一化，疊加區(qū)域用灰色陰影顯示。在圖 2(a) 中，綠色熒光染料 Alexa Fluor 488 和橙黃色熒光染料Alexa Fluor 555 在峰波長(zhǎng)處顯示很明顯的分離，人眼也很容易能夠區(qū)分。然而

5、，光譜疊加（灰色陰影區(qū)域）表明在 Alexa Fluor 555 的發(fā)射峰上很明顯有 AlexaFluor488 的發(fā)射光譜（用一條黑線標(biāo)示，從發(fā)射峰到橫坐標(biāo)）。當(dāng) Alexa Fluor488 的熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯比 Alexa Fluor 555 的熒光發(fā)射強(qiáng)時(shí)，熒光信號(hào)這么高程度的串色使得熒光探針的分離很難。很多因素都會(huì)導(dǎo)致這種情況發(fā)生，比如熒光團(tuán)標(biāo)的物濃度的巨大差異。因此，在共定位實(shí)驗(yàn)中，這些探針的組合就應(yīng)該避免，或只有當(dāng)圖像在多通道共焦模式采集下才可以使用，這樣可以降低或消除串色。圖 2Alexa Fluor 探針之間的光譜疊加程度會(huì)隨著探針發(fā)射峰之間的距離增加而下降，如 Figure

6、2(b)所示。在這種情況下， Alexa Fluor 488 和深紅色染料 AlexaFluor 633 與 Figure2 (a)比較，重疊區(qū)域明顯降低。這兩種染料人眼都很容易區(qū)分，光譜重疊程度低在共定位實(shí)驗(yàn)中可使串色最小化，如每個(gè)探針的濃度相似的話，應(yīng)該可以產(chǎn)生較好的結(jié)果（注意：深紅色的熒光染料 Alexa Fluor 633 在低濃度時(shí)通過(guò)顯微鏡目鏡很難觀察到）。 Alexa Fluor 633 可被紅色氦氖激光器的 633nm 線最有效的激發(fā)，也可被黃色氦氖激光器的 594nm 激發(fā)。或許，在 AlexaFluor染料發(fā)射的可見(jiàn)光區(qū)域，最好的光譜分離是 Alexa Fluor 488和

7、 Alexa Fluor647 的結(jié)合（圖中未顯示）。實(shí)際上，在這些染料之間沒(méi)有光譜重疊，即使樣品含有過(guò)量的 Alexa Fluor 488，應(yīng)該也沒(méi)有串色。具有這些特點(diǎn)的熒光探針是共聚焦顯微鏡分析共定位的理想選擇。在共聚焦顯微鏡中，測(cè)定共定位的能力受限于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率及用于照明樣品的入射光波長(zhǎng)。寬場(chǎng)熒光和共聚焦顯微鏡理論分辨率約為 200nm，但在實(shí)際上，由于各種原因這個(gè)數(shù)降到 400nm 和 600nm 之間，原因包括顯微鏡光路未完全對(duì)準(zhǔn)、光學(xué)折射率波動(dòng)、光學(xué)像差及樣品制備的不合適。然而，對(duì)于一個(gè)已經(jīng)完全調(diào)好的共聚焦顯微鏡來(lái)說(shuō)，兩個(gè)熒光分子是否連接到同一個(gè)目標(biāo)對(duì)象上，或者它們是否定位在同

8、一個(gè)器官上受光學(xué)分辨率影響。共定位的許多實(shí)驗(yàn)是圍繞高特異性的合成探針和抗體進(jìn)行的，標(biāo)記目標(biāo)是容易區(qū)分的局部的、明確的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對(duì)于厚度小于 5m 的樣品，比如貼壁細(xì)胞或很薄的組織切片，在常規(guī)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡下，定量的共定位分析一般是可以的。然而，對(duì)于厚樣品，圖像應(yīng)以具有一定軸向尺寸的光學(xué)切片來(lái)記錄，來(lái)分析看起來(lái)共定位的熒光團(tuán)是否真正位于同一個(gè)側(cè)向焦平面上，或在 Z 軸上他們是否彼此疊加。厚樣品的熒光團(tuán)共定位分析應(yīng)通過(guò)獲得薄的光學(xué)切片來(lái)進(jìn)行，可用激光掃描共聚焦顯微鏡、或轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡。多光子顯微鏡經(jīng)常用單個(gè)近紅外激光，在物鏡焦點(diǎn)處的特定區(qū)域激發(fā)雙標(biāo)樣品的兩個(gè)熒光團(tuán)。這些技術(shù)將熒光

9、發(fā)射局限在僅位于焦平面上的熒光團(tuán)，這樣大大降低了光漂白和背景噪音。共定位的軟件分析樣品中熒光團(tuán)共定位的程度是通過(guò)比較一幅圖上每個(gè)像素位置的顏色值測(cè)定的。分析的第一步就是要顯示進(jìn)行共定位測(cè)量的圖，一般以兩個(gè)獨(dú)立通道的合成圖顯示。當(dāng)分析多標(biāo)樣品時(shí)，在一次計(jì)算中，只能處理兩種偽彩，但所有偽彩排列之后都可以配對(duì)用于共定位分析。由于傳統(tǒng)上使用氬離子激光器、氪-氬離子激光器及氦氖激光器，這些激光器能夠有效地激發(fā)在藍(lán)色和綠色區(qū)域有強(qiáng)烈吸收的熒光團(tuán)，因此選擇紅綠顏色對(duì)作為共聚焦熒光顏色。此外，人眼對(duì)綠色和紅色色調(diào)更為敏感。圖像的共定位分析一般經(jīng)常用散點(diǎn)圖表示（ scatterplot），這個(gè)圖將兩套數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起

10、來(lái)。散點(diǎn)圖以二維圖的形式描述了一幅圖或一個(gè)感興趣區(qū)域每個(gè)像素處一個(gè)通道對(duì)另一個(gè)通道的強(qiáng)度值（見(jiàn)圖 3 和圖 4）。作圖時(shí)其中一個(gè)通道（通常是綠色）作為 x 軸，而另一個(gè)通道（通常是紅色）作圖時(shí)作為 y 軸，在橫坐。標(biāo)和縱坐標(biāo)上強(qiáng)度范圍是 04095. 因此，合成圖的每個(gè)像素點(diǎn)都有一對(duì)強(qiáng)度值。分析每一對(duì)強(qiáng)度值產(chǎn)生的分布圖案，能夠識(shí)別熒光團(tuán)的共定位、區(qū)分背景、串色、光漂白等。圖 3圖 3 描述了共聚焦的三個(gè)合成圖（偽彩為紅色和綠色），以及對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖，三個(gè)樣品熒光團(tuán)共定位的程度不同。每個(gè)通道中強(qiáng)度很低的像素位于靠近散點(diǎn)圖的（ 0,0）處，而越亮的像素分散得越遠(yuǎn)。在連接紅色通道和綠色通道的散點(diǎn)圖中，

11、純的紅色和綠色的像素點(diǎn)往往會(huì)團(tuán)聚在軸位置。而共定位的像素（如果有的話）看起來(lái)是彩色的，具有黃色和橙色的色調(diào)（取決于共定位的程度），落在 y=x位置附近，也就是散點(diǎn)圖的右上角。圖 3a 顯示的樣品為鼠腦冠狀位海馬切片，用 Alexa Fluor488 標(biāo)記神經(jīng)纖維，Alexa Fluor568 標(biāo)記神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白， GFAP。在圖 3b 中，印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞用 Alexa Fluor568 染色，標(biāo)記對(duì)象是黏著斑蛋白，同時(shí)用 AlexaFluor488 與鬼筆環(huán)肽作用，標(biāo)記對(duì)象是纖維狀的肌動(dòng)蛋白。而表達(dá)了熒光蛋白DsRed 和 EYFP 的兔腎上皮細(xì)胞，定位在核上，在圖 3c 中描

12、述。相關(guān)的散點(diǎn)圖直接位于樣品圖像的面，例如圖 3d 是圖 3a 的散點(diǎn)圖，兩個(gè)通道共定位的程度在每個(gè)散點(diǎn)圖的左下角用白色字母和數(shù)字表示。圖 3a 共定位程度相對(duì)較?。ㄖ挥邪俜种畮祝?，在圖 3b 和圖 3c 中共定位程度逐漸增加，共定位系數(shù)分別是 30%和85%。共聚焦顯微鏡及配件制造商提供的軟件可對(duì)熒光團(tuán)共定位進(jìn)行散點(diǎn)圖分析。圖 4 顯示了一系列分析圖，這個(gè)圖是印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞，用 AlexaFluor568 染色（標(biāo)記對(duì)象是黏著斑蛋白，紅色通道），同時(shí)用 Alexa Fluor488染色（標(biāo)記對(duì)象是纖維狀肌動(dòng)蛋白，綠色通道）。在散點(diǎn)圖中選擇一個(gè)感興趣區(qū)域進(jìn)行分析，在圖 4a 中用白顏色

13、的長(zhǎng)方形為這個(gè)感興趣區(qū)域設(shè)定了信號(hào)的閾值，大多數(shù)共定位分析軟件都可以進(jìn)行這種功能分析。感興趣區(qū)域的水平邊界和豎直邊界應(yīng)該排除背景信號(hào)，背景沿著散點(diǎn)圖的 x軸和 y 軸團(tuán)簇。只有被包括在所選擇區(qū)域邊界內(nèi)的像素信號(hào)才能進(jìn)行共定位分析。樣品上重疊的像素區(qū)域很容易轉(zhuǎn)變成共定位二元閾值像(圖 4b)，這個(gè)圖還可以和共聚焦圖疊加在一起，做一個(gè)共定位 map. 圖 4c 顯示的共定位 map 圖用白顏色顯示了共定位區(qū)域，對(duì)大多數(shù)軟件這個(gè)顏色很容易變成其他顏色，相對(duì)于原來(lái)的偽彩，對(duì)比度更高一些。圖 4正如上面所討論的，在共聚焦圖中對(duì)熒光團(tuán)共定位的定量測(cè)定，可通過(guò)散點(diǎn)圖和感興趣區(qū)域的信息獲得。從整個(gè)散點(diǎn)圖的信息

14、，可獲得很多變量值。Pearsons 系數(shù)就是用于分析整個(gè)散點(diǎn)圖的諸多變量中的一個(gè)，為描述兩幅圖之間重疊程度，在識(shí)別一幅圖像和另一幅圖像的匹配程度上， Pearsons, R(r)系數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。 Pearsons 相關(guān)系數(shù)根據(jù)下面方程計(jì)算：S1是第一個(gè)通道每個(gè)像素的強(qiáng)度值，而S2是第二個(gè)通道每個(gè)像素的強(qiáng)度值。S1(average)和S2(average)分別是第一個(gè)通道和第二個(gè)通道平均像素強(qiáng)度值。在 Pearsons 系數(shù)里，原始像素強(qiáng)度值減去平均像素強(qiáng)度值。結(jié)果，系數(shù)值范圍從-1到 1， -1 表示圖像的像素之間完全沒(méi)有重疊，而 1 表示完美的圖像重疊。Pearsons相關(guān)系數(shù)只解釋了

15、兩個(gè)圖像之間形狀的相似性，而與圖像像素強(qiáng)度值無(wú)關(guān)。然而，當(dāng)把這個(gè)系數(shù)值應(yīng)用到共定位分析時(shí)，潛在的負(fù)值難以解釋，需要用另一種方法解釋結(jié)果。用于計(jì)算另一相關(guān)系數(shù)的較簡(jiǎn)單的技術(shù)，需要去掉原始像素強(qiáng)度值和平均像素強(qiáng)度值這個(gè)差減項(xiàng)。 正式定義為 Overlap 系數(shù)（ R） ，這個(gè)值范圍從 0 到 1，在圖像分析中對(duì)強(qiáng)度變化不敏感。 Overlap 系數(shù)定義為：分子是兩個(gè)通道強(qiáng)度的乘積和，只有當(dāng)同一個(gè)像素的兩個(gè)通道值與共定位相關(guān)時(shí)，分子才會(huì)給出一個(gè)很有意義的值（兩個(gè)通道的像素強(qiáng)度值都大于 0）。因此，方程（ 2）的分子與共定位的像素?cái)?shù)成正比。同理， Overlap 方程的分母正比于圖像兩個(gè)通道組分的像素

16、數(shù)，而不考慮共定位是否存在（注意：組分定義為通道 1 和通道 2 紅顏色和綠顏色的圖或像素陣列）。 Overlap 系數(shù)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)就是對(duì)一個(gè)圖像上各種組分的信號(hào)強(qiáng)度差相對(duì)不敏感，信號(hào)強(qiáng)度差經(jīng)常是由熒光團(tuán)的濃度差、光漂白、量子效率變化及非等效的電子通道設(shè)置等產(chǎn)生的。使用 Overlap 系數(shù)最重要的缺點(diǎn)是：通道之間組分像素?cái)?shù)比例會(huì)強(qiáng)烈影響Overlap 系數(shù)值。為了減少這種依賴性， Overlap 系數(shù)分成兩個(gè)不同的子系數(shù)，看 k(1)和 k(2)，以兩個(gè)獨(dú)立的參量來(lái)表達(dá)共定位的程度。Overlap 系數(shù) k(1)和 k(2)描述了通道之間強(qiáng)度的差異， k(1)對(duì)通道 2（綠色信號(hào)） 強(qiáng)度差

17、敏感，而 k(2)線性依賴于通道 1 像素的強(qiáng)度值。因此，現(xiàn)在描述的方程能夠說(shuō)明重疊度，也能解釋顏色通道之間的強(qiáng)度差異。在圖像的共定位區(qū)域，為了估計(jì)其中一個(gè)顏色通道對(duì)整個(gè)共定位熒光的貢獻(xiàn)，定義了另外一套共定位系數(shù) m(1)和 m(2)。共定位系數(shù) m(1)用于描述通道 1 對(duì)共定位區(qū)域的貢獻(xiàn)，而共定位系數(shù) m(2)用于描述通道 2 對(duì)共定位區(qū)域的貢獻(xiàn)。注意，如 S2(i)大于 0 時(shí)，變量 S1(i,coloc)等于 S1(i)；對(duì)于變量 S2(i,coloc)也是這樣的。相對(duì)于每個(gè)熒光通道的總熒光量來(lái)說(shuō)，這些系數(shù)正比于 merge 圖像中每個(gè)熒光通道共定位熒光團(tuán)的熒光量。即使當(dāng)兩個(gè)熒光通道的

18、信號(hào)強(qiáng)度明顯在不同的檔次，共定位系數(shù) m(1)和 m(2)也能測(cè)定。另一對(duì)共定位系數(shù)可對(duì)散點(diǎn)圖上定義的感興趣區(qū)域內(nèi)像素強(qiáng)度范圍進(jìn)行計(jì)算。系數(shù) M(1)用于描述通道 1 熒光團(tuán)對(duì)共定位區(qū)域的貢獻(xiàn)，系數(shù) M(2)用于描述通道 2 熒光團(tuán)對(duì)共定位區(qū)域的貢獻(xiàn)。式中，如 S2(i)位于感興趣區(qū)域閾值范圍內(nèi)， S1(i,coloc)等于 S1(i)；如 S2(i)代表的像素在感興趣區(qū)域閾值外， S1(i,coloc)等于 0.相似地， 如 S1(i)位于感興趣區(qū)域閾值范圍內(nèi)， S2(i,coloc)等于 S2(i)；如 S1(i)代表的像素在感興趣區(qū)域閾值外， S2(i,coloc)等于 0. 換句話說(shuō)，

19、對(duì)每一個(gè)通道來(lái)說(shuō)，分子代表這個(gè)通道所有像素（且每個(gè)像素在另一個(gè)通道也有強(qiáng)度值）的強(qiáng)度和，而分母代表這個(gè)通道的所有像素的強(qiáng)度和。相對(duì)于每個(gè)通道的總熒光量來(lái)說(shuō)，這些系數(shù)與每個(gè)通道共定位對(duì)象的的熒光量成正比。大多數(shù)商業(yè)共定位分析軟件都能計(jì)算上面所描述的參數(shù)，包括 Pearsons 相關(guān)系數(shù)、總 overlap 系數(shù)以及 k(X)， m(X)和 M(x)共定位系數(shù)。此外，許多分析軟件包含的算法可進(jìn)行背景校正，產(chǎn)生整幅圖的散點(diǎn)圖，且可在一個(gè)雙通道合成圖或共聚焦圖的感興趣區(qū)域進(jìn)行計(jì)算。從這些軟件中獲得的最重要的數(shù)據(jù)就是共定位系數(shù)，這意味著信號(hào)之間重疊的相對(duì)程度。例如，通道 1 的熒光團(tuán)共定位系數(shù)為 0.7

20、5 意味著通道 1 中含有通道 2 組分的強(qiáng)度值占通道 1 總的強(qiáng)度值是 75%。這是一個(gè)相對(duì)比較高的共定位程度。同樣地，對(duì)通道 2 共定位系數(shù)為 0.25 意味著明顯降低的共定位。共定位分析中的假象及樣品考慮共定位分析遇到的一個(gè)最重要的問(wèn)題就是由發(fā)射光譜疊加、自熒光（主要存在于組織樣品）、非特異性抗體或合成熒光染料染色引起的光譜串色。熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)于光譜有疊加的共定位熒光團(tuán)來(lái)說(shuō)也是一種潛在的假象。當(dāng)觀察標(biāo)記有綠色、紅色熒光探針的樣品時(shí)，任何這樣一種假象都能產(chǎn)生看起來(lái)是黃色或橙色的像素，但這種顏色并不來(lái)自共定位。當(dāng)對(duì)兩種或兩種以上熒光染料標(biāo)記的樣品進(jìn)行成像時(shí)，最常見(jiàn)的問(wèn)題就是熒光串色問(wèn)題。

21、例如，當(dāng)用傳統(tǒng)的綠色和紅色熒光探針熒光素和羅丹明進(jìn)行雙標(biāo)時(shí)，串色只有用最優(yōu)的熒光濾色鏡組才能降低，但絕不會(huì)完全去掉。這是因?yàn)檫@樣一個(gè)事實(shí)：這些染料都有很寬的吸收和發(fā)射光譜，光譜之間有明顯的重疊。因此，激發(fā)熒光素的氬離子激光器的 488nm 線也能激發(fā)羅丹明，盡管激發(fā)程度較低。而且，在為羅丹明預(yù)設(shè)的光電倍增管通道或?qū)拡?chǎng)濾色鏡套組中也會(huì)檢測(cè)到熒光素的熒光發(fā)射，甚至在沒(méi)有共定位的地方，產(chǎn)生看起來(lái)是黃色或橙色的像素。要用這些染料或類似染料進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)，串色問(wèn)題必須完全消除。成探針克服，比如 Alexa Fluor 系列或 Cy 系列染料。這些專門(mén)設(shè)計(jì)的有機(jī)分子表現(xiàn)出很窄的發(fā)射光譜（與傳統(tǒng)探針相比）

22、、與弧光燈和激光線相匹配的較大的吸收系數(shù)、較高的量子產(chǎn)率、降低的光漂白,且熒光發(fā)射對(duì)環(huán)境變量的依賴性較低。此外，這些先進(jìn)探針的激發(fā)光譜線橫跨大約 400nm，從紫外到近紅外有一個(gè)很寬的選擇，以匹配照明光源，使得發(fā)射光譜疊加最小。自發(fā)熒光（對(duì)甲醛固定的組織樣品尤為顯著）產(chǎn)生的問(wèn)題在表現(xiàn)上與串色類似。有自發(fā)熒光的樣品激發(fā)后經(jīng)常會(huì)在其他通道檢測(cè)出熒光發(fā)射，使得到的照片看起來(lái)有共定位熒光團(tuán)。如用抗體和合成熒光團(tuán)對(duì)背景過(guò)度染色，也會(huì)在兩個(gè)熒光團(tuán)非特異性標(biāo)記明顯的地方產(chǎn)生看起來(lái)像共定位的圖像。這個(gè)假象可以通過(guò)認(rèn)真地制備樣品、用合適的 control 監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)方案來(lái)避免或明顯降低。只有當(dāng)所有的串色、自發(fā)熒光

23、、非特異性熒光問(wèn)題都消除掉后，共定位的研究才是準(zhǔn)確的。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，最有效的方法就是利用序列激發(fā)，并用窄的帶通發(fā)射濾色片或窄的狹縫寬度（光譜型）收集發(fā)射熒光。同時(shí)，應(yīng)該檢查單標(biāo)的 control 樣品，以確保完全消除了串色，未染色的 control 在監(jiān)測(cè)自熒光方面是很有效的。圖5激光掃描共聚焦顯微鏡中各種樣品串色的問(wèn)題及其校正在圖 5 中顯示。圖 5（ a）中的纖維原細(xì)胞， Alexa Fluor488 綠色熒光串色進(jìn)入 Mito Tracker 紅色通道，當(dāng)樣品用 488 激光和 543 激光同時(shí)掃描時(shí)，會(huì)產(chǎn)生黃色的肌動(dòng)蛋白絲。序列掃描和檢測(cè)（圖 5d）消除了串色影響。同樣地，

24、在用 Cy3 和核探針 DRAQ5 對(duì)老鼠大腸厚切片進(jìn)行同時(shí)掃描時(shí)（圖 5b），也會(huì)發(fā)生串色。序列掃描可以去掉串色假象（圖 5e），而串色假象會(huì)造成虛假的共定位。當(dāng)多標(biāo)樣品用兩種以上的激光掃描時(shí)，串色問(wèn)題在好幾個(gè)通道都會(huì)觀察到，圖 5（ c）和圖 5(f)顯示了鼠腦的一個(gè)厚切片，用 Alexa Fluor488 標(biāo)記神經(jīng)絲、用 Alexa Fluor 568 標(biāo)記神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，用 DRAQ5 染核。當(dāng)樣品同時(shí)用 3 個(gè)激光掃描時(shí)（圖 5c），串色會(huì)在第二和第三個(gè)通道發(fā)生，在樣品的中間絲里就意味著有可能的共定位。然而，若開(kāi)始用序列掃描并收集數(shù)據(jù)時(shí)，神經(jīng)絲只出現(xiàn)在它們各自的通道

25、里（圖 5f），消除了這些結(jié)構(gòu)中熒光團(tuán)共定位的可能。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，理論上可以測(cè)量位置離得很近的兩個(gè)熒光團(tuán)的距離，也是監(jiān)測(cè)共定位的一個(gè)潛在有用的工具。然而，在共定位分析中這個(gè)現(xiàn)象經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致一些假象，除非在實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過(guò)程中，對(duì) FRET 的一些參數(shù)做了很好地理解并認(rèn)真進(jìn)行了考慮。尤其是在第一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜和第二個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)光譜重疊的地方，研究者應(yīng)該特別關(guān)注。這些樣品中的能量轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為：第一個(gè)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射意外地降低同時(shí)伴隨著第二個(gè)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射意外地增加。緊密相關(guān)的熒光團(tuán)之間的相互作用可導(dǎo)致發(fā)射熒光信號(hào)的淬滅，這與環(huán)境條件有關(guān)。共定位分析中許多潛在的問(wèn)題都可通過(guò)仔細(xì)關(guān)注樣

26、品制備技術(shù)來(lái)規(guī)避。正如上面討論的，熒光探針應(yīng)該選擇發(fā)射光譜分離比較大的且具有最小疊加的組合。如果可能的話，選擇綠顏色的具有窄發(fā)射的熒光團(tuán)（比如 Alexa Fluor 系列或量子點(diǎn)）及紅顏色的在深紅區(qū)或近紅外區(qū)有發(fā)射的熒光團(tuán)。原發(fā)性和繼發(fā)性抗體必須檢測(cè)交叉活性及非特異性背景染色。合成熒光團(tuán)及標(biāo)記的繼發(fā)性抗體的濃度應(yīng)該優(yōu)化以確保相似的亮度，尤其是當(dāng)對(duì)象豐度根本不同時(shí)。影響熒光團(tuán)亮度的因素包括激發(fā)效率、量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、濃度及環(huán)境因素，如 pH值、離子濃度、疏水性及粘性。對(duì)每一個(gè)熒光團(tuán)都應(yīng)單獨(dú)制備 control 樣品，在不染色的情況下，分別分析串色和自熒光。仔細(xì)注意著色過(guò)程中的微小細(xì)節(jié)，就會(huì)降

27、低使用圖像處理軟件恢復(fù)數(shù)字圖像的必要性。共定位分析的實(shí)際情況在分析復(fù)雜的熒光圖像時(shí)，使用偽彩色組合很有用，這在上面已經(jīng)討論過(guò)了。通常，選擇兩個(gè)彩色通道，最常用的是綠色和紅色。因此，疊加區(qū)域顯示黃色。其他顏色對(duì)，比如藍(lán)色、綠色（產(chǎn)生青色），藍(lán)色、紅色（產(chǎn)生紫色）也會(huì)用到，但因?yàn)榉瓷涞乃{(lán)光對(duì)人眼靈敏度低，這些顏色對(duì)在實(shí)際觀察中很少使用。但在許多情況下，尤其是三色圖像，不可避免會(huì)使用藍(lán)色偽彩色。采集圖像及顯示參數(shù)方面，應(yīng)該采用一種標(biāo)準(zhǔn)以便使合成圖對(duì)每一個(gè)熒光信號(hào)顯示同樣的動(dòng)態(tài)范圍和補(bǔ)償。事實(shí)上，標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦顯微鏡操作將這種方法視為日常樣品分析方法。兩個(gè)圖像 merge 時(shí)，如果收集到的光子足夠，疊加

28、的紅色綠色信號(hào)就會(huì)產(chǎn)生明確的亮黃色。在光子極少的實(shí)驗(yàn)中，共定位熒光團(tuán)會(huì)產(chǎn)生暗黃色，而對(duì)背景具有相同貢獻(xiàn)的綠色和紅色會(huì)顯示棕色。每一個(gè)通道的 offset 和 gain 都應(yīng)該單獨(dú)調(diào)節(jié)（設(shè)置背景為 0，飽和為 4095），以便每一個(gè)熒光團(tuán)都顯示在完整的 12 位范圍里。然后，對(duì)每個(gè)圖像進(jìn)行單獨(dú)處理。盡管這是采集和顯示多色圖像的一個(gè)很方便的方法，但樣品中兩個(gè)信號(hào)的實(shí)際相對(duì)強(qiáng)度沒(méi)法測(cè)定，因?yàn)槊總€(gè)信號(hào)的采集都是為了滿足整個(gè) 12 位的圖像深度。因此，某一個(gè)顏色通道相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析要求各個(gè)通道以同樣的采集參數(shù)配置，比如光電倍增管電壓、增益和補(bǔ)償?shù)?。如果圖像采集和圖像處理技術(shù)沒(méi)有平衡好，在 merge

29、的彩色圖中，就會(huì)由于采集過(guò)程光電倍增管不合適的 Gain、 offset 配置及圖像處理過(guò)程中強(qiáng)度直方圖的極端拉伸而對(duì)共定位做出不準(zhǔn)確的解釋。舉個(gè)例子，如果 offset 值過(guò)高，就會(huì)發(fā)生很明顯的顏色分離，在低 offset 值下，在同樣的結(jié)構(gòu)下，觀察到的對(duì)比度就降低。對(duì)于一些關(guān)鍵應(yīng)用， ratio 成像技術(shù)可用于區(qū)分兩個(gè)信號(hào)是共定位還是只是部分疊加。圖6對(duì)完全校準(zhǔn)好的熒光成像系統(tǒng)，當(dāng)用不同的濾色鏡組時(shí)，樣品上一個(gè)點(diǎn)在檢測(cè)器上精確成像為一個(gè)點(diǎn)，也就是像素對(duì)像素。然而，不同顏色的通道 merge 時(shí)，物鏡的色差校正不夠、濾鏡光路沒(méi)有完全對(duì)準(zhǔn)都會(huì)使得熒光信號(hào)之間的記錄有差錯(cuò)。對(duì)具有復(fù)雜圖案的圖像或

30、明暗信號(hào)相混的圖像，這個(gè)可能就檢測(cè)不到。會(huì)得出這樣的結(jié)論：在結(jié)構(gòu)中的信號(hào)分布要么是明顯不同，要么是部分疊加的。在 merge 圖像的處理過(guò)程中，位移問(wèn)題可用許多軟件包通過(guò) panning 操作恢復(fù)原始記錄。通過(guò) panning 操作校正一系列不同顏色圖的過(guò)程中，需要樣品上有一個(gè)固定的參考點(diǎn)，這個(gè)參考點(diǎn)在每一層圖上都有。如不存在多標(biāo)的樣品參考點(diǎn)，就將多色的熒光微球稀釋后加入樣品中，用蓋玻片進(jìn)行封裝前，在每個(gè)視野中都會(huì)有幾個(gè)珠子。對(duì)于一些苛刻的應(yīng)用，幾個(gè)帶通二色鏡和發(fā)射濾色片可與不同的激光器或熒光團(tuán)特定的激發(fā)濾色片一起使用。這種濾光鏡組的配置一般用在共聚焦顯微鏡中，當(dāng)對(duì)顏色校正要求苛刻時(shí)，也可用于

31、寬場(chǎng)熒光顯微鏡。圖 6 顯示了上面討論的幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題，多標(biāo)樣品（注意：圖 6 中所有熒光團(tuán)都只顯示綠色和紅色兩種偽彩）經(jīng)常會(huì)妨礙共定位的準(zhǔn)確分析。用增強(qiáng)黃色熒光蛋白融合過(guò)氧化酶轉(zhuǎn)染人類女性骨肉瘤上皮細(xì)胞，目標(biāo)對(duì)象是縮氨酸序列（發(fā)綠色熒光），隨后用免疫熒光的方法，用二次抗體標(biāo)記 Alexa Fluor568(發(fā)紅光)，目標(biāo)對(duì)象是過(guò)氧化酶膜蛋白（ PMP-70），顯示在圖 6（ a）和圖 6（ d）中。圖 6（ a）中的背景太黑，致使標(biāo)記的黃色熒光蛋白強(qiáng)度降低。這種錯(cuò)誤使共定位分析發(fā)生偏移，對(duì)綠色通道中重疊的像素人為產(chǎn)生了較低的檢測(cè)量。合適的圖顯示在圖 6（ d），顯示了明顯較高的共定位程度。獼猴腎上皮細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)用 EYFP 和 HcRed1 熒光蛋白（此蛋白含有縮氨酸序列，目標(biāo)對(duì)象是線粒體）轉(zhuǎn)染。成像過(guò)程中，非常亮的 EYF