腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與雜交瘤技術(shù)

1、關(guān)于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和雜交瘤技術(shù)第一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要性 惡性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)建立細(xì)胞系，包括癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系可以是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞和一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞兩種。第二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和癌細(xì)胞系一樣具有永久性生長能力和惡性表型，對此二種來源的細(xì)胞系鑒定也是相似的，為研究惡性腫瘤提供了有用模型。而一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系只具有無限生長能力，不具有惡性細(xì)胞的表型，此種細(xì)胞系可相似于正常細(xì)胞的模型而被應(yīng)用。第三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細(xì)胞來源于體內(nèi)正常上皮細(xì)胞。癌細(xì)胞在體內(nèi)或體外一樣具有無控制生長和分化

2、不全的特點(diǎn)，因此比正常細(xì)胞容易培養(yǎng)建細(xì)胞系。如20世紀(jì)50年代，國外建立了宮頸癌的Hela細(xì)胞系。第四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細(xì)胞的增殖是按指數(shù)方式生長的，自一個(gè)癌細(xì)胞增殖到能觸及的程度要經(jīng)過30代（109，1cm3, 1g）。這樣1cm3大小的腫塊再經(jīng)過10代（ 1012 ，10 cm3，1Kg）。這樣的大小和重量時(shí)足以致病人于死亡。經(jīng)治療后如細(xì)胞數(shù)從1012減少至1010，重約10g時(shí)可稱顯效或部分緩解；若腫瘤細(xì)胞數(shù)減少到108或106，重約100mg至10mg時(shí)，可認(rèn)為臨床治愈或完全緩解，但仍有可能復(fù)發(fā)。要根治腫瘤細(xì)胞，必須徹底消滅所有癌細(xì)胞。外科手術(shù)切除大量腫瘤細(xì)

3、胞，但轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞仍有復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。第五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月癌細(xì)胞的迅速增殖擴(kuò)散受機(jī)體內(nèi)環(huán)境中多種因素的影響如各種生長因子、抑素、激素、多胺、基因調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期基因和癌基因、cAMP和cGMP濃度（前者對細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)，而后者為相反）。第六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月正常細(xì)胞周期的G1期有一個(gè)特殊的調(diào)節(jié)點(diǎn)R點(diǎn)，在生長條件不適宜情況下，細(xì)胞不能通過調(diào)節(jié)點(diǎn)而不增殖，細(xì)胞通過G1期進(jìn)入M期前受一種不穩(wěn)定蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)通過R點(diǎn)啟動DNA的合成，例如抑癌基因P53最重要的生物學(xué)功能就是通過調(diào)控細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)來維持基因組的穩(wěn)定性，當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí)，P53誘導(dǎo)細(xì)胞周期終止

4、或凋亡，而P53突變或缺失使P53功能失活則導(dǎo)致基因組紊亂，產(chǎn)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化。第七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月體內(nèi)細(xì)胞處于不同狀態(tài)，大概分成三種命運(yùn):繼續(xù)增殖細(xì)胞，不斷離開G1期通過細(xì)胞周期中不同時(shí)期（S 、G2、M）完成細(xì)胞分裂，如骨髓干細(xì)胞，胃腸上皮中的基底細(xì)胞等，不增殖細(xì)胞，這類細(xì)胞在分裂完成后，暫處于G1期，正常情況下不合成DNA，不進(jìn)入細(xì)胞分裂期，如肝細(xì)胞，只有受損或切除時(shí)肝細(xì)胞再分裂增殖。哺乳動物的初級卵細(xì)胞也屬于此類。不增殖細(xì)胞，這類細(xì)胞由R點(diǎn)走向分化細(xì)胞，并執(zhí)行專門功能的細(xì)胞（稱終末細(xì)胞）如神經(jīng)細(xì)胞、哺乳動物成熟的紅細(xì)胞、皮膚上皮的角質(zhì)細(xì)胞、多性核粒細(xì)胞。 第八張，

5、PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤和正常的組織同樣在體內(nèi)也具有三種不同的細(xì)胞群：增殖細(xì)胞群（A）：是腫瘤中處于增殖周期的細(xì)胞，與腫瘤生長直接有關(guān)，亦是化學(xué)療法最易攻擊的部分。第九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月暫不增殖細(xì)胞群（B），它是延長了G1細(xì)胞或G0細(xì)胞，目前不參加細(xì)胞周期，與腫瘤的擴(kuò)大暫時(shí)無關(guān)，由于它保留著增殖的能力，在一定條件下成為腫瘤復(fù)發(fā)根源。第十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月不再增殖群（C），它不再參與細(xì)胞周期，而日趨衰老，死亡，對腫瘤增長無意義。腫瘤的增長情況取決于3種細(xì)胞群的比例，腫瘤增殖率（growth factor GF）可由下列關(guān)系來

6、決定：GF=AA+B+C。A群細(xì)胞越多， B、C群細(xì)胞越少，腫瘤惡性程度越高。第十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月常應(yīng)用體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，模擬體內(nèi)環(huán)境或確定單因素多因素研究腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展結(jié)局。觀察抗癌藥物對細(xì)胞周期作用點(diǎn)的影響也常應(yīng)用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)。若能確定腫瘤細(xì)胞各周期時(shí)間，選擇各期針對性藥物進(jìn)行治療，則可以提高療效。第十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月放線菌素D作用于G1期抑制DNA聚合酶合成，作用于S后期與G2期抑制rRNA并影響cAMP水平。放線菌素D不影響非分裂期細(xì)胞，因而放線菌素D是一種細(xì)胞周期特異性藥物。第十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022

7、年6月阿糖胞嘧啶，選擇性地抑制核苷二磷酸還原酶，阻斷核苷酸變?yōu)槊撗鹾塑账?，從而抑制DNA合成，是DNA合成抑制劑，屬于S期特異性藥物。第十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月秋水仙素能與微管蛋白強(qiáng)烈結(jié)合，引起微管解體，紡錘體破壞，結(jié)果染色體的移動被阻斷，細(xì)胞分裂停留在中期，它是屬于M期的特異性藥物。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察抗癌藥物對細(xì)胞周期作用點(diǎn)將常用的抗癌藥物的細(xì)胞周期分類。第十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月數(shù)十年來醫(yī)生們除用手術(shù)外只能用放療和化學(xué)療法來治療癌癥，這些療法毫無分別地同時(shí)殺死健康細(xì)胞和癌細(xì)胞，直到人類基因組圖譜的解密，我們才迎來了適用少數(shù)病人的靶向性治療新

8、時(shí)代，醫(yī)生們首先分析病人腫瘤中的DNA（基因），再開出靶向性復(fù)合藥物的藥方，專門攻擊腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺陷的基因，達(dá)到治療癌癥的目的。第十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)前較有前景的靶向治療現(xiàn)在發(fā)展的基因工程腺病毒（ONYX-015）因刪除了E1B 55KD蛋白而可以選擇性的溶解P53突變或缺失的腫瘤細(xì)胞，此類腫瘤細(xì)胞占50，也就是腺病毒ONYX-015可達(dá)到50的靶向治療藥物的效果，目前已在頭頸部腫瘤中進(jìn)行期臨床試驗(yàn)。第十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)前較有前景的靶向治療腫瘤對化療和放療抗性的一種機(jī)制是由于P53突變或P53的缺失，人類癌50 % P53突變Non

9、 small cell lung 60 %Colon 50 %Breast 40 %Head and neck 60 %Ovarian 60 %第十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月制備單克隆抗體，主要是靶向表皮生長因子EGF受體EGFR和HER-2。80年代研究人員發(fā)現(xiàn)，在人類的腦部、肺部和胰腺等部位的腫瘤中EGFR的含量極高，Artrazeneca公司的研究人員于1998年率先提出通過開發(fā)阻斷EGFR的藥物，可以抑制腫瘤的生長，這種全新的療法就是現(xiàn)在的靶向性療法，它沒有毒副作用，不會殺死正常細(xì)胞，按照這種思路，基因技術(shù)公司開發(fā)出一種治療晚期乳腺癌的藥物Herceptin，并于1

10、998年獲準(zhǔn)上市。Herceptin是一種單克隆抗體藥物，靶向HER-2，這種藥物能使只有5個(gè)月壽命的晚期乳腺癌病人繼續(xù)生存。為什么Herceptin成功獲準(zhǔn)，由于臨床試驗(yàn)中沒有同時(shí)對所有乳腺癌患者進(jìn)行試驗(yàn)，而是選擇了其中的一小部分（大約占25）的那些HER-2含量異常高的晚期乳腺癌患者。第十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月Astrazeneca公司的肺癌藥Iressa等都是靶向藥物，靶EGFR，但成功的只有Herceptin。Iressa只在10肺癌患者中有神奇作用，但在大規(guī)模的臨床試驗(yàn)中90人無效?；?億美元，10年時(shí)間，未獲批準(zhǔn)。第二十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022

11、年6月腫瘤發(fā)生發(fā)展結(jié)局的機(jī)理研究進(jìn)入分子水平，人類最終認(rèn)識腫瘤才可以征服腫瘤。若癌變 的始發(fā)變化是基因活動的調(diào)控失常，癌變就具有潛在的可逆行，就可以為腫瘤治療開辟一個(gè)完全新的途徑控制調(diào)控機(jī)制；若癌變的本質(zhì)是基因突變，那就意味著癌變不可逆，只有了解其突變的部位，只有通過基因治療，而所有這種機(jī)理的研究，其中一個(gè)重要的手段是通過腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)進(jìn)行研究。雖然體外培養(yǎng)不能完全反映體內(nèi)情況，但為單因素、多因素研究提供模型。第二十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境是復(fù)雜的，每個(gè)人影響腫瘤細(xì)胞形成因素復(fù)雜，在應(yīng)用單克隆抗體治療肺癌病人過程中發(fā)現(xiàn)對每個(gè)人的療效不一致，這就需要開創(chuàng)個(gè)

12、體化抗腫瘤治療的研究，而開展個(gè)t體化抗腫瘤治療的基礎(chǔ)，首先將每個(gè)病人的腫瘤細(xì)胞特征（如腫瘤抗原表達(dá)）細(xì)胞因子的作用，抗癌藥物的篩選，進(jìn)行研究，這是一個(gè)巨大的工作，不是一兩個(gè)人能完成，需要有一個(gè)群體共同協(xié)作完成，前后期研究人員通力合作才可完成。第二十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、癌細(xì)胞系的建立 癌細(xì)胞來源于體內(nèi)正常上皮細(xì)胞。癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)一樣具有無控制生長和分化不全的特點(diǎn)，因此比正常細(xì)胞容易培養(yǎng)和建系。早在20世紀(jì)50年代，國外建立宮勁癌的Hela細(xì)胞系以來，隨著細(xì)胞培養(yǎng)和技術(shù)的改進(jìn)，人各種器官組織來源的癌細(xì)胞系不斷問世，國外已建立很多癌細(xì)胞系。第二十三張，PPT共一百二

13、十頁，創(chuàng)作于2022年6月盡管癌細(xì)胞在體外較容易存活和建系，但仍存在一定困難。最主要的問題是從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變，阻斷了癌細(xì)胞在體內(nèi)從周圍正常間質(zhì)組織和血管獲取癌細(xì)胞生長最適營養(yǎng)（包括生長因子），及間質(zhì)細(xì)胞過度生長，耗竭了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，特別是培養(yǎng)基的改進(jìn)，促進(jìn)了癌細(xì)胞建系的成功。 第二十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)癌細(xì)胞建系的方法和程序相似于正常細(xì)胞，包括標(biāo)本收集和處理、消化和培養(yǎng)、傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等過程。針對癌細(xì)胞特點(diǎn)有以下改進(jìn)內(nèi)容。第二十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1標(biāo)本收集和取材 癌細(xì)胞是異質(zhì)性

14、的，因此取癌組織最外層組織最活躍細(xì)胞，同時(shí)要注意除去標(biāo)本中混雜的間質(zhì)組織。第二十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月為了克服癌細(xì)胞群體的異質(zhì)性，在原代培養(yǎng)取材時(shí)可考慮采用轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，如轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)、癌性胸腹水等。轉(zhuǎn)移組織中的癌細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過生長優(yōu)勢選擇，群體細(xì)胞比較均一，增殖細(xì)胞群比腫瘤細(xì)胞更易于生長。取材后盡快將癌組織進(jìn)行培養(yǎng)，一般4小時(shí)內(nèi)細(xì)胞存活最好。標(biāo)本在4存放，不要超過24小時(shí)。第二十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月人癌細(xì)胞建系必須要有完整的記錄，包括組織來源、病人姓名、住院號、年齡、性別、臨床診斷、病理診斷（應(yīng)明確分類分期）、術(shù)前放化療情況，為細(xì)胞建系的重要材料

15、。為了鑒定建立的細(xì)胞系來源和生物學(xué)特性，最好留有病人正常組織和血標(biāo)本。第二十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2分散癌組織 癌組織多為較堅(jiān)實(shí)實(shí)體（少數(shù)例外，如卵巢癌、腦癌），含有豐富的間質(zhì)細(xì)胞，因此用酶消化癌組織，是分散癌細(xì)胞的好的方法。少數(shù)含結(jié)締組織不多的癌組織可選用機(jī)械分散的方法。機(jī)械分散對癌細(xì)胞損傷小，但有過多的纖維細(xì)胞從結(jié)締組織中離散出來。 第二十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月胰蛋白酶(trypsin)是最常應(yīng)用的酶，但它對結(jié)締組織的消化能力有限，適合含結(jié)締組織較少的腫瘤，并且trypsin對細(xì)胞膜有損害作用，影響細(xì)胞存活。膠原酶消化癌組織證明更有效，可抑制

16、結(jié)締組織細(xì)胞的生長。膠原酶的消化方法：0.5mgml膠原酶處理，可在顯微鏡下觀察，纖維細(xì)胞逐漸被除去為止。用Hanks液或培養(yǎng)基洗滌，除去附著細(xì)胞的酶，再進(jìn)行接種和培養(yǎng)。第三十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)腫瘤組織標(biāo)本很小，不能用酶消化獲取癌細(xì)胞時(shí)，可以用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。體內(nèi)惡性腫瘤呈外向浸潤生長，腫瘤過快，使腫瘤中心組織呈壞死，因此取材時(shí)應(yīng)避開這部分。但癌組織中不可避免有已經(jīng)耗竭和壞死的細(xì)胞，因此在酶消化組織前，應(yīng)盡可能清除這些細(xì)胞，以免接種后很快溶解破壞，釋放出影響癌細(xì)胞生長的有害物。第三十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3接種腫瘤細(xì)胞 trypsin消

17、化或collagenase消化的腫瘤組織制備的癌細(xì)胞，應(yīng)有足夠的細(xì)胞密度，通常接種細(xì)胞濃度為5105ml，37培養(yǎng)，通常3周左右可見飼養(yǎng)層上有集落生長。第三十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4成纖維細(xì)胞過度生長的去除 上面已介紹了癌組織中成纖維細(xì)胞過度生長對癌細(xì)胞生長和建系有影響。用選擇培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層等方法可以克服其過度生長?？蓱?yīng)用以下方法：第三十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）機(jī)械排除法：將玻璃吸管前端在火焰上燒彎曲，用作除去成纖維細(xì)胞的工具?？稍陲@微鏡下直接刮除生長的成纖維細(xì)胞，也可事先在顯微鏡下對有成纖維細(xì)胞生長的單層培養(yǎng)瓶上做出標(biāo)記，然后按標(biāo)記刮除。刮

18、除后，用培養(yǎng)液洗12次后，加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)。如需要可多次刮除。第三十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）反復(fù)貼壁：根據(jù)腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞貼壁快慢的差異，可以把兩種細(xì)胞分開。用消化酶消化細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶后，加入培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶（A）放置371020分鐘左右，將培養(yǎng)上清倒到另一培養(yǎng)瓶（B），加入新培養(yǎng)基，放置371020分鐘，將B瓶上清倒入C瓶，置37培養(yǎng)。將A、B、C瓶與37培養(yǎng)2448小時(shí)后于顯微鏡下觀察，將含有成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)瓶棄去，保留含上皮細(xì)胞的培養(yǎng)瓶。如果上皮細(xì)胞中仍含有成纖維細(xì)胞，可按上述方法繼續(xù)重復(fù)處理，直到成纖維細(xì)胞去除。第三十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于

19、2022年6月5培養(yǎng)基 在癌細(xì)胞建系中，選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用是提高癌細(xì)胞體外存活、抑制成纖維細(xì)胞生長的關(guān)鍵技術(shù)改進(jìn)。選擇培養(yǎng)基是針對特殊細(xì)胞生長的營養(yǎng)要求設(shè)計(jì)的。針對癌細(xì)胞的特點(diǎn)，選擇性培養(yǎng)基應(yīng)含少量血清。第三十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月血清對上皮細(xì)胞有抑制作用有利于成纖維細(xì)胞生長。因此用低或無血清培養(yǎng)基為好。改良RPMI-1640培養(yǎng)基可提高癌細(xì)胞存活。HITES選擇培養(yǎng)基，加有氫化可的松（hydrocordisone）、胰島素(insulin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(tramsferrin)、雌激素(estradiol)、硒(selenium)等成分。HITES培養(yǎng)基適合用于人小細(xì)胞

20、肺癌建系。Insulin、tramsferrin、selenium、hydrocordisone、EGF、BSA、和丙酮酸鈉（sodium pyruvate）。為了抑制成纖維細(xì)胞生長，在培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞的抗體或成纖維細(xì)胞代謝抑制成分，也可提高癌細(xì)胞系建系率。第三十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月6飼養(yǎng)層 在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細(xì)胞貼壁生長和抑制癌組織中正常成纖維細(xì)胞過度生長。第三十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月可以應(yīng)用多種組織來源的成纖維細(xì)胞如人胎小腸細(xì)胞、FHS741作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞，小鼠3T3細(xì)胞或S

21、TO胚胎成纖維細(xì)胞常被應(yīng)用作飼養(yǎng)層。將trypsin或collagenase消化的腫瘤組織細(xì)胞制備的單細(xì)胞懸液，接種到形成單層的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，腫瘤細(xì)胞可形成集落，成纖維細(xì)胞不形成。第三十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月飼養(yǎng)層的制備將經(jīng)過放射處理的小鼠3T3細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶。材料：無菌3T3細(xì)胞，培養(yǎng)基，絲裂霉素C 5ug/ml（無血清培養(yǎng)配制或BSS），X-ray或60Co,30Gy照射。方法：trypsin 消化體外傳代培養(yǎng)的3T3細(xì)胞，再以105/ml細(xì)胞濃度接種。50%細(xì)胞出現(xiàn)匯合，加入0.25ug/ml絲裂霉素C 2ug/106細(xì)胞，過夜（或用放射60Co代替）。24小時(shí)

22、后換液，trypsin消化細(xì)胞，再接種到新培養(yǎng)瓶，每毫升5104細(xì)胞加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)作為飼養(yǎng)層。第四十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的換液和傳代第四十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1換液通常細(xì)胞產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)上清呈黃色（培養(yǎng)瓶中含有酚紅pH指示劑）時(shí)，需要及時(shí)換液，癌細(xì)胞在對數(shù)期增殖迅速，每天均需換液，倍增時(shí)間較長的細(xì)胞可以隔日換一次。第四十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2傳代 原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞應(yīng)掌握合適的第二代傳代時(shí)間。一般不需要等細(xì)胞長到100%匯合才傳代。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞生長特點(diǎn)不同，表現(xiàn)為重疊生長。

23、當(dāng)在顯微鏡下觀察到上皮樣細(xì)胞匯合達(dá)50%左右，可見細(xì)胞層上堆積有圓形的細(xì)胞，指示細(xì)胞增殖活躍時(shí)就可以傳代。 第四十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月常規(guī)傳代：原代培養(yǎng)物第一次傳代后，需要常規(guī)傳代維持細(xì)胞在體外正常生長。細(xì)胞象正常細(xì)胞一樣在體外 生長可分為潛伏期、對數(shù)期和平坦期。盡管各種來源的癌細(xì)胞系倍增時(shí)間快慢不同，每種細(xì)胞系傳代時(shí)間有所不同。通常在細(xì)胞接種后5天左右傳代一次。一瓶原癌細(xì)胞傳到15瓶。如果計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，每瓶可接種（24）105細(xì)胞。為建成永久性細(xì)胞系需長期傳代達(dá)50次以上。第四十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3凍存和復(fù)蘇 建立癌細(xì)胞系需要在體外進(jìn)行長

24、期培養(yǎng)和傳代，傳代50次以上才能被認(rèn)做是永久性細(xì)胞系。因此，建系過程需要不斷凍存細(xì)胞以防止細(xì)胞系中斷。凍存不同傳代次數(shù)的細(xì)胞液為了提供各種代數(shù)的癌細(xì)胞為科研應(yīng)用。體外長期傳代可能引起基因不穩(wěn)定，在細(xì)胞表型上發(fā)生改變，影響研究結(jié)果。因此，從第一代傳代后，就應(yīng)盡早地凍存培養(yǎng)物。凍存細(xì)胞和復(fù)蘇方法與正常細(xì)胞相同，可參照正常細(xì)胞。第四十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）人肺癌細(xì)胞建系人肺癌細(xì)胞系的建立。從外科切除的人肺癌標(biāo)本取材，用胰酶消化組織成單細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，加入含10%滅活胎牛血清的RPMI1640生長培養(yǎng)基，CO2暖箱37培養(yǎng)。第四十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作

25、于2022年6月1、材料 無菌組織培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)瓶、吸管等。眼科剪刀、鑷子、含攪拌磁棒的玻璃燒瓶。生長培養(yǎng)基：RPMI1640+10%滅活胎牛血清。消化液：0.5%胰蛋白酶（trypsin）+0.04%乙二胺四乙酸二鈉溶液（EDTA），PBS。小型磁力攪拌器。第四十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、方法 從手術(shù)切除的肺鱗癌、腺癌、肺泡細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌等標(biāo)本無菌取腫瘤組織，放入無菌玻璃瓶，立即送實(shí)驗(yàn)室（不需滅菌），每例癌標(biāo)本有明確記錄，包括患者姓名、性別、年齡、手術(shù)時(shí)間、病理診斷等。將每種腫瘤組織各放入無菌平皿，去除血塊和壞死組織，用無菌PBS沖洗多次，直到無血跡。轉(zhuǎn)移各標(biāo)本到

26、另一平皿中，用無菌小型刀剪從腫瘤組織切下外層（細(xì)胞活性好）癌塊，放于另一無菌平皿中。用剪刀將平皿中癌組織剪成12mm小塊，放入有磁力攪拌棒的小玻璃三角燒瓶中。第四十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月加入消化液（0.5%trypsin+0.04%EDTA）覆蓋組織塊。燒瓶放在磁力攪拌器上，緩慢攪拌15分鐘。重復(fù)步驟4，直到細(xì)胞組織塊完全消化，收集消化液于瓶中。吸出收集的消化液到另一個(gè)滅菌玻瓶中。離心3000rpm，15分鐘，棄上清。用含血清培養(yǎng)基懸浮沉淀。計(jì)數(shù)細(xì)胞。制備5105/ml細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶（細(xì)胞懸液所占空間為培養(yǎng)瓶的1/3）。置37，CO2溫箱培養(yǎng)。接種細(xì)胞48小時(shí)后

27、，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，如細(xì)胞已大部分貼壁，可換液一次，清除上清中的死細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基。第四十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、結(jié)果接種細(xì)胞后319天（鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌），細(xì)胞開始生長。細(xì)胞為上皮樣（鱗腺癌）和圓形小細(xì)胞（小細(xì)胞癌）。細(xì)胞貼壁生長，增殖速度不同，分別從23112天傳第一代，細(xì)胞失去接觸性抑制，重疊生長。從低代開始凍存細(xì)胞，建立了 肺鱗癌細(xì)胞系，命名為LTEP-S（lung trmor epithelial pulmonary-squamous）；2個(gè)肺腺癌細(xì)胞系，為LTEP-al（adenocarcinoma-l）LTEP-a2；肺泡細(xì)胞癌細(xì)胞系， L

28、TEP-a3；小細(xì)胞肺癌，為LTEP-Sm(small cell line lung cancer)。第五十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）注意事項(xiàng)盡快培養(yǎng)腫瘤組織是獲得癌細(xì)胞建系重要的因素。及時(shí)去除生長的成纖維細(xì)胞（用刮除的方法較為簡便），有利于癌細(xì)胞的生長。掌握好第一次傳代時(shí)間，擴(kuò)增均勻生長優(yōu)勢的癌細(xì)胞，使其在體外能夠成為細(xì)胞系。精心傳代、換液、避免污染，需經(jīng)半年以上的細(xì)胞培養(yǎng)，方能夠達(dá)到建立細(xì)胞系的目的。第五十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系建立轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變而引起恒定表型改變的事件。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系可由于細(xì)胞本身基因不穩(wěn)定

29、（嚙齒類）在傳代中自發(fā)發(fā)生，也可用放射、致突變劑、病毒以及外源基因等因素處理，引起細(xì)胞產(chǎn)生遺傳改變。 第五十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化細(xì)胞系主要有3個(gè)類型改變： 有限分裂的細(xì)胞變?yōu)闊o限增殖的細(xì)胞，獲得不死性，成為永久性細(xì)胞系。細(xì)胞不正常自主性生長，喪失細(xì)胞接觸性抑制、過飽和密度、無停泊依賴等正常細(xì)胞生長特點(diǎn)。致瘤性。細(xì)胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)浸潤生長，形成腫瘤。 第五十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月判斷惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系最主要的指標(biāo)。惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系已具有惡性表型。一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系也可能在體外有不正常的生長表型，但在體內(nèi)不能形成腫瘤。第五十四張，PPT共

30、一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1誘變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法（1）轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇：可從原代培養(yǎng)的正常細(xì)胞、傳代的正常細(xì)胞選擇。成纖維細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞較難。第五十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）轉(zhuǎn)化因素：化學(xué)致突變劑，常用的甲基硝基亞硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine,MNNG）；物理方法：射線照射；病毒轉(zhuǎn)化：用EB病毒傳染淋巴細(xì)胞引起轉(zhuǎn)化，SV40病毒轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞成為惡性細(xì)胞；用外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，已獲得較高的轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)化的外源基因包括癌基因如ras、mye，病毒基因，如SV40LT抗原基因、端粒酶基因等。第五十六張，PPT

31、共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2外源基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，包括以下程序： 選擇合適的外源基因，如SV40LT抗原基因傳染人成纖維細(xì)胞有效。構(gòu)建外源基因表達(dá)載體（質(zhì)粒），含有合適的標(biāo)記基因作為陽性傳染細(xì)胞的選擇（質(zhì)粒上有新霉素耐受基因，可用G418選擇）。第五十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法：化學(xué)方法最常用磷酸鈣、脂質(zhì)體（lipfectin）、基因槍、電轉(zhuǎn)移等。選擇合適的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲陽性集落。證明外源基因有無表達(dá)。證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表型是否改變和有無致瘤性。第五十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）SV40LT抗原基

32、因轉(zhuǎn)化人的成纖維細(xì)胞： 雖然鼠來源的成纖維細(xì)胞可以經(jīng)培養(yǎng)后成為長期培養(yǎng)的細(xì)胞系，但人的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)很難成為永久細(xì)胞系。用SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人成纖維細(xì)胞是最成功的方法。第五十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料HEPES緩沖液，10CaHEPES，2CaHEPES磷酸緩沖液，NaAc,Tris-EDTA緩沖液，無水乙醇，Eagles MEM/15%FCS，G418。均為無菌液。第六十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法1）制備轉(zhuǎn)化所需DNA：制備DNA-磷酸鈣溶液：DNA20ug/ml，CaCl2 0.125M，NaPO4 0.75mM，NaCl 140m

33、M，HEPES 12.5Mm，pH 7012。2）轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備：對數(shù)生長的成纖維細(xì)胞，稀薄啊達(dá)7080%匯合，轉(zhuǎn)化前一天換液，用無血清培養(yǎng)基。3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞：將1mlDNA磷酸鈣沉淀加入到培養(yǎng)皿（3ml）覆蓋細(xì)胞，處理6小時(shí)或更長，于37 CO2暖箱。第六十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4）去除和洗滌培養(yǎng)液，加入生長培養(yǎng)基（EMEM，15%FCS）培養(yǎng)48小時(shí)后，加入G418 200ug/ml。5）更換培養(yǎng)基，含G418濃度可降低或不變，鑒定耐受集落生長，直到大多數(shù)細(xì)胞死亡。6）可利用克隆環(huán)，挑選集落，用trypsin消化單個(gè)集落，繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞繼續(xù)生長。7）盡早凍存細(xì)胞，

34、傳代中多次凍存。8）持續(xù)傳代細(xì)胞，直到細(xì)胞死亡，不能再傳代。第六十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果可建立永久傳代的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。但有可能用此方法建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系不一定具有惡性特征，可能與所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因穩(wěn)定有關(guān)。第六十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項(xiàng)】永久細(xì)胞系的建立，細(xì)胞具有過度生長的“危相”，大多數(shù)細(xì)胞死亡，僅少數(shù)集落出現(xiàn)。通過及時(shí)換液，保持培養(yǎng)液pH恒定和補(bǔ)充營養(yǎng)。第六十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）轉(zhuǎn)染端粒酶基因，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立： 端粒酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，抵消細(xì)胞分裂所致端?？s短，是癌細(xì)胞獲得不死性的重要分子機(jī)制。轉(zhuǎn)

35、染外源端粒酶基因于有限期傳代的正常細(xì)胞系，包括人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，均可誘導(dǎo)產(chǎn)生永久性細(xì)胞系，并證明了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，端粒酶表達(dá)和端粒縮短受到了控制。第六十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月最近有報(bào)告證明了用猿SV40病毒基因和人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因（HTERT gene）兩種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)染人的上皮細(xì)胞，均可獲得不死性細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)可檢測到端粒酶活性和控制了端?？s短。第六十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月SV40誘導(dǎo)的不死性細(xì)胞，伴有細(xì)胞不正常分化和核型不穩(wěn)定，表現(xiàn)出對動物一定程度的致瘤性。而端粒酶傳染的細(xì)胞很少有核型的改變和上皮細(xì)胞分化的特點(diǎn)，保持更多

36、正常細(xì)胞的表型。說明用SV40LT抗原基因和HTERT gene 轉(zhuǎn)化細(xì)胞存在一定差異，SV40LT多引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而HTERT gene 主要誘導(dǎo)細(xì)胞獲得不死性。第六十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）轉(zhuǎn)基因小鼠： 利用轉(zhuǎn)基因小鼠可以建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，基本方法是設(shè)計(jì)有某種基因突變、缺失、嵌入病毒基因的DNA，植入小鼠的卵母細(xì)胞。發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小鼠將攜帶有表達(dá)某種基因的組織，從小鼠組織取材，可以獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。例如H2kbtsA58轉(zhuǎn)基因小鼠，含有SV40LT抗原，從小鼠各種組織取材，可以建立多種永久轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。因此，利用轉(zhuǎn)基因小鼠是建立細(xì)胞系快速有效的方法。第六十八張，PP

37、T共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）EB病毒感染B細(xì)胞建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系EB病毒感染人外周血B淋巴細(xì)胞后，B細(xì)胞便能夠被轉(zhuǎn)化，并在體外繼代生長，建立細(xì)胞系，長期儲存的液氮，解決研究中大量細(xì)胞的來源。第六十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料和方法：取健康人外周血5ml，加肝素（10u/ml）抗凝常規(guī)免疫方法分離淋巴細(xì)胞，用RPMI-1640含10%新生牛血清培養(yǎng)液，洗滌一次 1000rpm 10min離心，沉淀細(xì)胞懸浮于RPMI-1640 20%胎牛血清 調(diào)整細(xì)胞濃度。第七十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月EB病毒 標(biāo)準(zhǔn)株 B95-8 細(xì)胞系可產(chǎn)生高濃度EB病毒上清

38、（5105/ml），用0.22um微孔濾膜過濾獲細(xì)胞培養(yǎng)上清分裝儲存?zhèn)溆?。第七十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月淋巴細(xì)胞特征：取淋巴細(xì)胞懸液1ml，EB病毒1ml加至培養(yǎng)瓶混勻，371h，吸附后，加入34ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，375%CO2孵育35天后用倒鏡觀察淋巴細(xì)胞程度，補(bǔ)加培養(yǎng)液 當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)1106/ml，離心收集懸浮細(xì)胞，凍存液氮，同時(shí)采用合成黃染檢測細(xì)胞活性，以細(xì)胞存率來評估細(xì)胞凍存前后的活性，一般凍存前的細(xì)胞活性約95%，凍存后為90%。第七十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月在轉(zhuǎn)化過程中，淋巴細(xì)胞的濃度（2105/ml）和EB

39、病毒的滴度、用量、新鮮程度-70儲存9個(gè)月內(nèi)EB病毒1ml均對淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化為適合，轉(zhuǎn)化成功率達(dá)85100%。但在EB病毒轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的同時(shí)，又能刺激T細(xì)胞亞群的活性，細(xì)胞毒T細(xì)胞作用B細(xì)胞使轉(zhuǎn)化失敗，克服這一作用可通過控制淋巴細(xì)胞接種密度和加入環(huán)胞素A來消除毒性T細(xì)胞作用。（參考鄭從義等報(bào)導(dǎo)）第七十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系注意事項(xiàng)第七十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月針對癌細(xì)胞建系存在的問題，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，包括：采用無血清或低血清培養(yǎng)基，可以抑制成纖維細(xì)胞的生長和降低其對癌胞生長不利的影響。同時(shí)補(bǔ)充癌細(xì)胞生長必要的成分。如上

40、皮生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等。事實(shí)上僅少數(shù)建立的癌細(xì)胞系使采用無血清培養(yǎng)基。這可能與無血清培養(yǎng)需加入的其他成分價(jià)格昂貴和制備不便有關(guān)。第七十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月接種癌細(xì)胞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，有利癌細(xì)胞的生長。除去生長的成纖維細(xì)胞。由于組織培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，國外癌細(xì)胞建系率已很高。國內(nèi)癌細(xì)胞的建系還較少，就組織培養(yǎng)方法仍待改進(jìn)。第七十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，通常用已建成的正常細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所以不存在上述癌細(xì)胞建系原代培養(yǎng)所存在的問題。能否建成轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除要選擇合適的細(xì)胞系外（遺傳形狀過于穩(wěn)定的細(xì)胞不易轉(zhuǎn)化）對轉(zhuǎn)化方法的選擇也很關(guān)鍵。

41、轉(zhuǎn)染外源病毒基因，如SV40LT，有較高的轉(zhuǎn)化率。該方法在國內(nèi)已能很好應(yīng)用。從轉(zhuǎn)基因小鼠組織取材建立細(xì)胞系在國外已有一些報(bào)告，該方法的應(yīng)用，不僅提高了建系率，而且使那些常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法不能建立的細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)基因動物可以建立攜帶某種靶基因的細(xì)胞系，為細(xì)胞培養(yǎng)和建立細(xì)胞系開拓了新的局面。第七十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定癌細(xì)胞有染色體DNA、RNA已經(jīng)蛋白質(zhì)水平的分子異常和惡性表型，癌細(xì)胞系應(yīng)反映來源癌組織的分子異常和惡性表型。因此，癌細(xì)胞系的鑒定主要包括細(xì)胞組織來源和惡性特征。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)步，對癌細(xì)胞認(rèn)識的深入，反映在鑒定癌細(xì)胞系惡性特

42、征的指標(biāo)也越來越多。轉(zhuǎn)化細(xì)胞如果是正常細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來，不需再進(jìn)行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，已經(jīng)確定是惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化。第七十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定癌細(xì)胞有染色體DNA、RNA已經(jīng)蛋白質(zhì)水平的分子異常和惡性表型，癌細(xì)胞系應(yīng)反映來源癌組織的分子異常和惡性表型。因此，癌細(xì)胞系的鑒定主要包括細(xì)胞組織來源和惡性特征。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)步，對癌細(xì)胞認(rèn)識的深入，反映在鑒定癌細(xì)胞系惡性特征的指標(biāo)也越來越多。轉(zhuǎn)化細(xì)胞如果是正常細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來，不需再進(jìn)行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，已經(jīng)確定是惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化。第七十九張，PPT

43、共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）細(xì)胞形態(tài)學(xué)1光鏡直接檢查結(jié)果癌細(xì)胞呈多邊形上皮樣細(xì)胞，易于和正常成纖維細(xì)胞區(qū)分。癌細(xì)胞正失支正常細(xì)胞間接觸性抑制，呈現(xiàn)重疊生長?？梢娂?xì)胞重疊層上有折光度強(qiáng)的圓形細(xì)胞。這些特點(diǎn)可與正常上皮細(xì)胞區(qū)分，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可出現(xiàn)與癌細(xì)胞重疊生長相似的特點(diǎn)。第八十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細(xì)胞染色檢查見正常細(xì)胞鑒定，除Giemsa染色外，可用瑞氏結(jié)晶紫等染色結(jié)果癌細(xì)胞呈多邊形，排列不規(guī)則，細(xì)胞重疊。細(xì)胞核大，核漿比例增大，深染突出、不規(guī)則，可見異常分裂象。有的上皮樣轉(zhuǎn)化細(xì)胞有相同特點(diǎn)。第八十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

44、的檢查結(jié)果細(xì)胞核大，不規(guī)則。胞漿內(nèi)如觀察到橋粒、張力原纖維等可上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，觀察到分泌顆粒是腺細(xì)胞特點(diǎn)，如有神經(jīng)分流顆粒是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特點(diǎn)。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查對于鑒定細(xì)胞系的組織來源和細(xì)胞惡性特點(diǎn)有重要意義。第八十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）染色體異常癌細(xì)胞存在多種染色體水平的異常。癌細(xì)胞是異倍體，存在染色體缺失、重排和移位等異常，染色體顯帶技術(shù)可用于檢查和鑒別正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞染色體差異。檢查染色體異常除用普通方法外，還可用染色體分帶技術(shù)來檢查染色體細(xì)微改變。染色體分帶技術(shù)是用特殊技術(shù)將染色單體上著色出深淺帶（band），顯示染色體的結(jié)構(gòu)。第八十三張，PPT共一百二

45、十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、trypsin-G 帶染色材料：細(xì)胞中期染色體標(biāo)本（見正常細(xì)胞染色體分析部分），trysin-Giemsa混合染液，水浴箱。方法（1）預(yù)處理：癌細(xì)胞系中期染色體標(biāo)本置6080水浴30分鐘左右或37過夜，取出玻片放入0.025M磷酸緩沖液（pH6.8）5610分鐘（2）用新配置的trypsin-Giemsa混合顯帶液處理10-30分鐘（3）封片：染色后用自來水沖洗（沖洗標(biāo)本背后，以色沖洗過分，使細(xì)胞脫落），封片第八十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果可見到清晰的每條染色體和上面的分帶。癌細(xì)胞核型異常為異倍體，多在亞二倍體和三倍體之間，與正常細(xì)胞二倍體

46、不同，每條染色體數(shù)目有增多或減少。在每條染色體上帶型與正常標(biāo)準(zhǔn)相比，有缺失和增加的帶以及移位等異常表現(xiàn)。通常轉(zhuǎn)化為異倍體。第八十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、Giemsa顯帶法材料細(xì)胞中期染色體標(biāo)本，trypsin消化液，Giemsa染液，水浴箱。方法（1）預(yù)處理：標(biāo)本置入6080溫箱20-30分，37烤箱過夜。（2）trypsin消化：3-5分鐘，沖洗多余的酶（3）將標(biāo)本放入Giemsa染液中染色10分鐘（4）封片：自來水沖洗，晾干后二甲苯透明2-3分鐘，封入樹膠第八十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果可見到清晰的每條染色體和染色體上的分帶。癌細(xì)胞核型為異

47、倍體，多在來二倍體和三部體之間，與正常細(xì)胞二倍體不同，每條染色體數(shù)目有增多或減少。在每條染色體上的帶型與正常標(biāo)準(zhǔn)相比，可以顯示染色體帶區(qū)細(xì)微結(jié)構(gòu)改變，如移位、倒置、缺換等異常這些異常是細(xì)胞系的遺傳標(biāo)記。如幾乎在100%的小細(xì)胞肺癌和腎癌有三號染色體短臂缺失發(fā)生，為鑒定細(xì)胞系的組織來源提供了依據(jù)。從染色體核型分析可以辨別是人或鼠來源（見正常細(xì)胞系鑒定）。第八十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）體外生長異常癌細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）體內(nèi)外無控制增殖是惡性細(xì)胞的特征。癌細(xì)胞喪失正常細(xì)胞接觸性抑制、停泊依賴等生長特點(diǎn)，表現(xiàn)為增殖加速，生長呈過程和密度，在軟瓊脂上形成集落等不正常生長特點(diǎn)，通

48、過以下實(shí)驗(yàn)，對于鑒定惡性生長有重要意義。第八十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、生長曲線和倍增時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)歷一代（從上一代傳代到下一次傳代的時(shí)間，通常7天左右），包括潛伏期、對數(shù)期、平坦期三個(gè)階段。通過計(jì)數(shù)7天細(xì)胞，可以記錄出生長階段，繪制出生長曲線，計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間。可鑒定癌細(xì)胞和正常細(xì)胞群體生長增殖速度的差異。第八十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料0.25% trypsin +0.04%EDTA消化液，含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，0.1%臺酚藍(lán)溶液，平皿，培養(yǎng)皿，血球計(jì)數(shù)器，半對數(shù)紙。第九十張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1

49、）對數(shù)期生長的細(xì)胞于試驗(yàn)前一天換液。如檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可同時(shí)接種轉(zhuǎn)化前細(xì)胞，以便比較。（2）用trypsin消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，用生長培養(yǎng)基制備3X104/ml細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞接種于25個(gè)直徑35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿3ml，于CO2暖箱37培養(yǎng)。第九十一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（3）次日于顯微鏡下挑選細(xì)胞生長均勻的培養(yǎng)皿，共21皿。（4）每日取3個(gè)平皿trypsin消化，將細(xì)胞懸液用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞（0.1%臺酚藍(lán)溶液0.9ml加入0.ml細(xì)胞懸液），計(jì)算活細(xì)胞平均數(shù)，連續(xù)7天。（5）以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上繪制生長曲線，并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)

50、間。第九十二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果癌細(xì)胞潛伏期短，對數(shù)期生長明顯，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化前細(xì)胞相比較，可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞對數(shù)期生長速度明顯增加。依據(jù)生長曲線，計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間。倍增時(shí)間短，反映了細(xì)胞惡性生長。第九十三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)為了制備準(zhǔn)確的細(xì)胞生長曲線，接種的細(xì)胞數(shù)要合適，對于癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通常接種3X104/ml細(xì)胞。但在不同細(xì)胞系生長速度差異較大，可以根據(jù)情況調(diào)整。為了防止每皿細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)誤差，可以在開始時(shí)多接種幾皿細(xì)胞，以便挑選細(xì)胞生長更均一的平皿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每日計(jì)數(shù)至少3皿，減少皿間差異。第九十四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于20

51、22年6月2、克隆效應(yīng)（cloning efficiency）克隆效應(yīng)也可稱為集落形成率（rate ov colohy formation），是檢測群體細(xì)胞中增殖細(xì)胞的比率，可反應(yīng)細(xì)胞系的增殖能力，因此是鑒別腫瘤細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與正常細(xì)胞的增殖能力的指標(biāo)。材料培養(yǎng)皿，生長培養(yǎng)基，甲醇，Gimsa染液，血球計(jì)數(shù)器。第九十五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1）對數(shù)生長的癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其母系細(xì)胞，每種細(xì)胞接種3個(gè)平皿，于實(shí)驗(yàn)前一天換液。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況良好，用trypsin充分消化，必須制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度稀釋到每毫升250或150個(gè)

52、細(xì)胞，每個(gè)平皿接種2ml細(xì)胞懸液（每皿300或500個(gè)細(xì)胞）第九十六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24周。（3）取平皿，用PBS沖洗自然干燥，用甲醇固定10分鐘，Giemsa染色。立體顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，每個(gè)集落需達(dá)50個(gè)細(xì)胞。（4）計(jì)算集落形成率：集落形成率=平均集落數(shù)/每皿接種的細(xì)胞數(shù)。 第九十七張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有較高的集落形成率，通?？蛇_(dá)10%以上，正常細(xì)胞有較低的集落形成率，僅1%左右。第九十八張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)該實(shí)驗(yàn)是檢測在群體細(xì)胞中增殖細(xì)胞的比率，試驗(yàn)需接種低密度

53、細(xì)胞，3cmX3cm平皿接種300500個(gè)細(xì)胞，消化細(xì)胞要充分，以保證制備單個(gè)細(xì)胞懸液和接種單個(gè)細(xì)胞形成的集落。由50個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，低于50個(gè)細(xì)胞不能計(jì)數(shù)。第九十九張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、放射自顯影測定細(xì)胞飽和密度核素放射自顯影是用核素電離輻射對核子乳膠感光作用顯示核素的分布、定位和定量的方法。嘌呤和嘧啶堿基是細(xì)胞DNA合成的前體，標(biāo)記有放射性核素的堿基加入培養(yǎng)細(xì)胞液中，可以滲入到細(xì)胞DNA合成，細(xì)胞經(jīng)過洗滌，固定涂乳膠，干燥后，于暗室中曝光，經(jīng)顯影后，細(xì)胞可在光鏡下檢測銀顆粒，計(jì)算出標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。由于癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞失去接觸性抑制，無限制性生長，因

54、此標(biāo)記指數(shù)高。第一百張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月材料DMEM培養(yǎng)基+10%滅活胎牛血清，用DMEM培養(yǎng)基配制，3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine），使?jié)舛葹?u Gi/ml，PBS ，0.25%TRYPSIN+0.04%EDTA，含蓋玻片的培養(yǎng)皿，血球計(jì)數(shù)器，固定細(xì)胞，冷醋酸甲醇（acetic:methanol為1：3,ice-cold）新鮮制備，去離子水，放射自顯影，乳膠，曝光盒。第一百零一張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月方法（1）培養(yǎng)細(xì)胞和核素標(biāo)記：對數(shù)期生長的癌細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）于試驗(yàn)前一天換液，0.25%trypsin+0.04%EDTA 充分消化細(xì)胞

55、，用含血清DMEM制備每毫升105個(gè)細(xì)胞懸液，接種到多個(gè)含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，于CO2暖箱37培養(yǎng)。2-3天后，每日換液。當(dāng)蓋玻片細(xì)胞已成片匯合，每日取出玻片，用消化液消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞。當(dāng)蓋玻片上計(jì)數(shù)細(xì)胞，已達(dá)到平坦期，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞表面，去除血清。加入2ml含1uci/ml的胸腺嘧啶DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)于CO2暖箱37。第一百零二張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）固定細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗玻片以去除未標(biāo)記的核素，將蓋玻片旋轉(zhuǎn)在載玻片上，細(xì)胞面朝上，細(xì)胞用冷醋酸甲醇固定10分鐘。（3）放射自顯影：涂片乳膠：暗室紅燈下46水浴中，熔化乳

56、膠，將培養(yǎng)細(xì)胞的小玻片用膠布固定在載玻片上，浸泡乳膠，保持在465秒鐘，俁乳膠均勻涂細(xì)胞上，取出的玻片放在切片架上，使乳膠習(xí)題成薄片，使其慢慢干燥（2-3小時(shí)）。把干燥片放入嚴(yán)密的曝光盒內(nèi)，于4冰箱曝光。曝光時(shí)間長短取決于多種因素，一般3-7天不定。第一百零三張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月顯影和定影：顯影時(shí)間取決于核素的劑量，一般20左右，顯影35分鐘，經(jīng)過1%醋酸溶液1-3分鐘，置于定影液中30-60分鐘。染色和封片：用水洗2分鐘，用去離子水洗1次，用Giemsa染色，將蓋玻片黑覆蓋在玻片上封片。鏡檢：高倍光鏡下可見細(xì)胞核銀染顆粒，為標(biāo)記陽性。第一百零四張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果計(jì)數(shù)標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)（核或細(xì)胞有銀染顆粒 ）占總細(xì)胞數(shù)的百分率，為標(biāo)記指數(shù)。癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)高于正常細(xì)胞，顯示過飽和生長，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與母系相比有明顯差異。第一百零五張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng) 應(yīng)將檢測的細(xì)胞培養(yǎng)到平坦期時(shí)加入核素標(biāo)記細(xì)胞，以顯示癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞失去正常細(xì)胞接觸抑制或呈過飽和密度生長。為了很好計(jì)數(shù)細(xì)胞中的銀染顆粒，應(yīng)保證細(xì)胞中的銀染顆粒呈較高密度。應(yīng)在實(shí)驗(yàn)操作中避免殘留核素造成的細(xì)胞背底過高，影響計(jì)數(shù)結(jié)果。第一百零六張，PPT共一百二十頁，創(chuàng)作于2022年6月4、軟瓊脂集落試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化