農(nóng)產(chǎn)品分析蛋白質(zhì)測定

1、第五章 蛋白質(zhì)的測定1 蛋白質(zhì)的測定方法pro的測定方法分為兩大類： 一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量; 另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定pro含量。 蛋白質(zhì)用凱氏法測定，因其中尚有氨基酸、酰氨等非蛋白質(zhì)氮，故稱“粗蛋白質(zhì)”，若用重金屬鹽等沉淀分離以后，進行全氮測定，由氮換算成的蛋白質(zhì)含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。2測定蛋白質(zhì)最常用的方法為凱氏定氮法 凱氏定氮法是通過測定出樣品中的總氮含量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。經(jīng)過人們長期的應(yīng)用和不斷改進，凱氏定氮法已演變成常量法、微量法、半微量法、改良凱氏法及自動定氮法等。3優(yōu)點： 具

2、有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、回收率好及不需昂貴儀器等優(yōu)點。缺點： 操作較費時(除自動凱氏定氮法外)，單消化過程一般就需要23h，如果遇到高脂肪、高蛋白樣品消化需要5h以上；在操作過程中會產(chǎn)生大量有害氣體。 4 為滿足生產(chǎn)單位對工藝過程快速控制分析，減少環(huán)境污染和操作簡便省時，后來在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上又陸續(xù)出現(xiàn)了水楊酸比色法、雙縮脲法、水合茚三酮法、染料結(jié)合法、紫外分光光度法、折光法、旋光法、近紅外線光譜法以及測定開氏消煮液中銨的靛酚藍法和納氏比色法。5重點介紹凱氏定氮法、染料結(jié)合法、雙縮脲法 三種方法。測定氨基酸主要的方法是利用氨基酸自動分析儀、茚三酮法、染料結(jié)合法、乙醛酸法、熒光法等。重點介紹氨

3、基酸自動分析儀法測定全氨基酸、染料結(jié)合法測定賴氨酸及乙醛酸法測定色氨酸。6 粗蛋白質(zhì)的測定凱氏定氮法 這種方法是1883年丹麥人開道爾(JKjeldahl)發(fā)明，當(dāng)時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間，后來由Gunning進行改進，他是在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的330上升到400，所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。7優(yōu)點：具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、回收率好及不需昂貴儀器等優(yōu)點。缺點：操作較費時

4、(除自動凱氏定氮法外)，單消化過程一般就需要23 h，如果遇到高脂肪、高蛋白樣品消化需要5 h以上；在操作過程中會產(chǎn)生大量有害氣體。 8我們在檢驗農(nóng)產(chǎn)品中pro時，往往只限于測定總氮量，然后乘以pro核算因數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實際上包括氨基酸、酰氨、核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，故稱為粗pro。如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進行全氮測定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。9（一）方法原理 氮素是蛋白質(zhì)中的主要成分。同類植物蛋白質(zhì)的含氮量基本上是固定的。因此，可將測得含氮值乘以換算因數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。 10 樣品與硫酸和催化劑一同加熱后消化，使

5、蛋白質(zhì)分解，其中的碳和氫分別被氧化成二氧化碳和水逸出，而有機氮轉(zhuǎn)化成氨后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后在堿性條件下蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。該過程的反應(yīng)方程式表示如下：11消化：2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 (NH4)2SO4 + 6CO2+ 12SO2 + 16H2O蒸餾：(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3+ Na2SO4 + 2H2O吸收：2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO412在消

6、化過程中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時間，常加入硫酸鉀、硫酸銅等物質(zhì)。加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物分解，因為它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度。但其加入量不能太大，否則消化溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失。13（二）操作步驟 1、蛋白質(zhì)的沉淀 2、蛋白質(zhì)的消煮 3、氮的測定 14 樣品（0.5mm）沸水取下放置30分鐘1、蛋白質(zhì)的沉淀 沸 騰5minCuSO4溶液NaOH溶液 ？放置半至1小時傾瀉法過濾沉淀沸水洗滌烘干60152、蛋白質(zhì)的消煮沉淀濃H2SO4放置2小時或過夜110的CuSO4K2SO4小火加熱加大火力至無色透明冷卻后煮30min電爐消

7、煮液呈棕色163、氮的測定 蒸餾法： 吸取定容后的澄清待測液（常量法可吸取25-50毫升，含氮約10-20毫克；半微量法吸取1-5毫升，含氮約0.5-1毫克），用常量法或半微量法測氮，同時做空白試驗。 17(三)各種試劑的作用:濃H2SO4： A ：脫水使有機物炭化，然后有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變?yōu)镃O2 B： 氧化 C： pro與濃H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O D： NH3與H2SO4生成硫酸銨18CuSO4的作用（催化劑）起催化作用外，還可作消化終點和下一步蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑。Cu2SO4為紅色沉淀，當(dāng)C完全消化后，反應(yīng)停止，紅色消失，變?yōu)樘m

8、色，即為消化達到完全，蘭色為CuSO4的顏色。193、硒粉和過氧化氫、氧化汞都為催化劑，但考慮到效果、價格及其環(huán)境污染等，通常采用硫酸銅。4. NaOH的作用 堿性條件下蒸餾使氨游離。205、K2SO4的作用（提高沸點） 沸點由330提高到400加速了反應(yīng)過程，加速有機物的分解。21（四）適用范圍凱氏定氮法適用于各類農(nóng)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)測定，最低檢出量為0.05mg氮，相當(dāng)于0.3mg蛋白質(zhì)，本法測出的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量22（五）注意事項蛋白質(zhì)沉淀劑通常采用堿性硫酸銅，它有迅速得到澄清溶液的優(yōu)點。牧草、塊根塊莖作物：堿性醋酸鉛為沉淀劑。谷物及油料作物：由于堿性醋酸鉛在沉淀蛋白質(zhì) 時產(chǎn)生不易沉淀的渾

9、濁物，因此不易正確 決定沉淀完全的終點，故少采用。下一頁23（五）注意事項1、樣品應(yīng)均勻，若是固體樣品應(yīng)事先研細，液體樣品要混合均勻。2、樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。243、消化過程中應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全。4、消化時，如不容易呈透明溶液，可將凱氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2-3ml，促使氧化。255、在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。6、如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會

10、引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過少，底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。267、混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。8、氨是否完全蒸餾出來，pH試紙檢查餾出液是否為堿性。279、向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深藍色的絡(luò)合物。10、所有的試劑溶液應(yīng)用不含氮的蒸餾水配制。2811、消化劑變綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。但對于特別難以氨化的氮化合物樣品，如含賴

11、氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵較多時，呈較深綠色。2912、樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時必須先低溫消化，并時時搖動；或者加入少量辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。3013、若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣15ml的比例增加硫酸用量。14、蒸餾時加入氫氧化鈉溶液必須小心輕加，而且蒸餾裝置不能漏氣。15、加堿要足量（反應(yīng)室液體呈深藍色或褐色）并且堿液不能污染冷凝管及接收瓶。3116、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40，否則對氨的吸收作用減弱而

12、造成損失，此時可置于冷水浴中使用。另外，冷凝管下端不能插入硼酸液面太深，一般約為0.5cm，這樣萬一發(fā)生倒吸現(xiàn)象時，硼酸液不致吸入反應(yīng)室內(nèi)。17、蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸lmin后關(guān)掉熱源，否則可能導(dǎo)致吸收液倒吸。3218、一般樣品中尚含其他含氮物質(zhì)，測出的蛋白質(zhì)為粗蛋白。若要測定樣品的“純蛋白質(zhì)”，則需向樣品中加入蛋白質(zhì)沉淀劑如氫氧化銅、堿性醋酸鉛、20-25單寧、10-12三氯乙酸溶液等，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)即可得“純蛋白質(zhì)”量。3319、在蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠嗥駝t將發(fā)生倒吸。20、

13、稱樣量的大小取決于樣品的含氮量。若含氮為1.05.0，稱樣量為0.30g，可根據(jù)含氮量的水平適當(dāng)增減稱樣量。稱樣量不宜少于0.1g，如果樣品含氮量高，可將消煮好的溶液定容，取一部分用于蒸餾、滴定。3421、廢液排除及洗滌。22、氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)中的氮含量一般為1517.6，按16計算乘以6.25即為蛋白質(zhì)量。不同食物中蛋白質(zhì)換算系數(shù)不同。3536核對試驗 將已知量的NH4+-N標(biāo)準(zhǔn)溶液(如100mg/LNH4+-N標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml，其中含N1mg)放入半微量定氮蒸餾裝置中，按樣品測定同樣操作步驟進行蒸餾、滴定，用以檢驗蒸餾過程中的誤差大小。指示劑的加入量仍為2（v/v）37硼酸的濃

14、度可根據(jù)樣品中氮的含量來調(diào)節(jié)2-5。測定兩種蛋白質(zhì)的平行結(jié)果為15以下，相對誤差不得大于3，1530時為2，30以上為1。其他參見土壤全氮的測定，如催化劑仍用1.85g較合適。 38二、同類種子中蛋白質(zhì)的測定(染料結(jié)合DBC法) (一)方法原理 蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的NH2、咪唑基和胍基（賴氨酸的-NH3+、 組氨酸的咪唑基、 精氨酸的胍基）以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH=23的酸性緩沖液體系中呈陽離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質(zhì)如橘黃G、酸性橙12#等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)染料絡(luò)合物而沉淀下來。39 通過測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反

15、應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。 染料結(jié)合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。40賴氨酸（-NH2 ）組氨酸（咪唑基） 精氨酸（胍基）41在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中蛋白質(zhì)的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關(guān)性。因此，可以用染料結(jié)合量來評比同種作物種子大量原始材料之間蛋白質(zhì)含量的高低。42如果要從染料結(jié)合量來計算樣品的粗蛋白質(zhì)的含量，則需用開氏法測定同類種子的一批樣品的粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，同時也用染料結(jié)合法測定其染料結(jié)合量，然后求出粗蛋白質(zhì)含量()對染料結(jié)合量的回歸方程或繪出回歸曲線。這樣，測定未知樣品的染料結(jié)合量，就可以從

16、回歸方程計算或查回歸線得到粗蛋白質(zhì)()含量。43該法是間接測定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡單、快速，與開氏法的相關(guān)性較好，但準(zhǔn)確性較差，適用于大批樣品的篩選工作。美國谷物化學(xué)協(xié)會將該法列為分析小麥蛋白質(zhì)含量的正式方法(AACC11-272)。44（二）注意事項1該法對隨意混合物的樣品不適用。2. 樣品稱樣量按蛋白質(zhì)含量的高低而定。水稻、小麥、大麥等可稱取500mg，玉米稱取700mg，大豆稱取200mg，花生及魚粉等可少一些。3染料結(jié)合反應(yīng)的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應(yīng)時間和溫度等影響到測定的結(jié)果，故應(yīng)力求每次測定的反應(yīng)條件一致，特別是測定樣品與測定回歸方程的樣品時的反應(yīng)條件一致。4

17、5三、同類種子中蛋白質(zhì)的測定(雙縮脲法)（一）原理： 蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)(類似于雙縮脲的反應(yīng)基團)，在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶解性絡(luò)合物，蛋白質(zhì)含肽鍵多時反應(yīng)呈紫色，反之肽鍵少時，反應(yīng)呈紅色。這種顏色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(或稱縮二脲反應(yīng))。 實驗證明，蛋白質(zhì)溶液濃度在115mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。4647本法須用開氏法作標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。經(jīng)試驗其與開氏法的相關(guān)性較好.優(yōu)點：此法簡單，快速,適于快速分析，使用儀器設(shè)備簡單，尤適用于大批品種選擇用。適用樣品廣泛，如小麥、大麥、水稻、玉米和高粱等蛋白質(zhì)的測定，皆能獲得良好的效果。缺點：靈敏度不高，樣品用量大，比較麻煩（事先

18、要用凱氏法測蛋白質(zhì)含量，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算回歸方程）。48（二）說明及注意事項 1.蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響不大。 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線做完整之后，無需每次再做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3.含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去。 4.樣品中有不溶性成分存在時，會給比色測定帶來困難此時可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進行測定。495.當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時，若有多量糖類共存，則顯色不好，會使測定值偏低。6.該法為美國谷物化學(xué)協(xié)會(AACC)測定谷物蛋白質(zhì)的正式方法，且已有據(jù)此法原理為基礎(chǔ)的快速測定蛋白質(zhì)的自動分析儀。7.一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質(zhì)的分析，因為它不穩(wěn)定，而且會浸出有色物質(zhì)、脂肪及一些淀粉物質(zhì)，干擾比色測定。508.而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質(zhì)的溶解，排除干擾。9.對一些顏色較深的種子測定，則應(yīng)先以四氯化碳處理已稱好的樣品，并用10g/LH202降解有色物質(zhì)，然后再加入雙縮脲試劑，以消除對測定結(jié)果的影響。10.本法對溫度及時間的要求嚴格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫2025 ，須于120-190min內(nèi)比色；40為1570min顯色穩(wěn)定