釀酒酵母的大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)

1、生物工程綜合實驗實驗 釀酒酵母的大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)1實驗原理 本實驗通過對15升中型發(fā)酵罐的了解及使用，將整個微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程分成幾個階段，系統(tǒng)的表現(xiàn)了發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程，包括使用發(fā)酵設(shè)備前期整個設(shè)備給水、給無菌空氣、給高壓蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在實際操作過程中各個管路之間的切換，發(fā)酵用各個檢測設(shè)備的標定。并以釀酒酵母的純化培養(yǎng)開始、再進行搖瓶放大、最后實現(xiàn)發(fā)酵罐的發(fā)酵生產(chǎn)的具體實驗過程，讓學生學會在發(fā)酵過程中能夠分階段的進行采樣檢測，根據(jù)檢測值對發(fā)酵的條件進行必要的調(diào)節(jié)，最后對于發(fā)酵所得到的產(chǎn)物進行必要的分離純化，制成成品并保存，從而掌握整個發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程的具體實施過程。實驗簡介

2、215升發(fā)酵罐圖示3發(fā)酵罐罐路示意圖空氣流量計電加熱器冷凝管空氣水蒸氣A03A02A01S03S01S02VT1V01P02W01C01W03W02罐體4管路說明一、空氣及其凈化 來自空壓機的壓縮空氣經(jīng)凈化器（外接減壓穩(wěn)壓器、除水、除塵、空氣預(yù)過濾器）進入發(fā)酵罐空氣總管，空氣流量計A01、閥A02、單向閥、空氣過濾器、閥A03到達反應(yīng)器內(nèi)，尾氣經(jīng)閥排出，本管路具有計量、凈化作用。注：空氣流量級顯示的流量是以過濾器前的壓力下的流量，不是標準狀態(tài)下的流量。二、蒸汽蒸汽進夾套蒸汽經(jīng)閥S01進入夾套（上進），經(jīng)閥V01排出冷凝水。蒸汽對培養(yǎng)基預(yù)熱。蒸汽進反應(yīng)器蒸汽經(jīng)閥S02、單向閥、空氣過濾器、閥A0

3、3進入罐內(nèi)，由排氣口控制閥VT1排出。蒸汽對過濾器及空氣管線消毒。蒸汽進取樣閥及放料閥蒸汽經(jīng)閥S03進入取樣閥，由閥P02排出冷凝水。蒸汽對取樣閥及底閥滅菌。三、自來水自來水進夾套當電磁閥C01打開時，自來水經(jīng)自動注水閥、閥W01進入反應(yīng)器夾套（下進），由夾套上口、閥W02、加熱器、電磁閥C01排出；當電磁閥關(guān)閉時，夾套水經(jīng)W02進入電加熱器、循環(huán)泵、單想閥進入夾套（下口），通過夾套水的循環(huán)，將加熱器的熱能帶入夾套，通過夾套的換熱加熱發(fā)酵液。注：溫度自動前必須對夾套注水自來水進排氣冷凝器自來水經(jīng)閥W03進入排氣冷凝器，對發(fā)酵尾氣進行冷卻盡可能減少培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。5實驗步驟葡萄糖1g氯化鉀1.

4、8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g蒸餾水1000mL一、發(fā)酵前的準備工作1酵母菌活化：由種子活化到試管斜面上。2按照下列配方配制麥氏（Meclary）培養(yǎng)基300ml，113滅菌20min。 將300ml種子培養(yǎng)液分成兩份，無菌操作取釀酒酵母菌斜面菌苔，接種于種子培養(yǎng)液，搖床培 養(yǎng)2448小時。 3補料液的配制及滅菌：配制0.2mol/L NaOH溶液、0.6mol/L HCl溶液、食用油分別裝入補料瓶中，將連在補料瓶上的橡皮管，用繩子扎緊，121滅菌20min。4培養(yǎng)基的制備：酵母膏25g、NaAc82g、KCl 18g、葡萄糖10g。加水溶解攪拌均勻。 65溶氧電極標定：零點標定：將電極拔

5、出浸沒于飽和的無水亞硫酸鈉溶液中，待電極顯示值穩(wěn)定后標零點1。斜率標定：溶氧電極的斜率（滿度）標定一般在發(fā)酵之前，溫度、罐壓、通氣量均在正常情況下進行，一般以100標定，因為它是個相對值，也可以是其他數(shù)值，罐壓對溶氧量影響較大，標定時應(yīng)保持罐壓相對穩(wěn)定。6pH電極標定：pH電極零點和斜率不能在發(fā)酵狀態(tài)下標定，只能在滅菌以前進行，但可以在發(fā)酵過程中進行零電位補償。標定前電極需泡于液體中并已聯(lián)機1小時以上，通常采用兩點標定法：先將電極洗凈擦干，然后浸入6.86緩沖液，并將零點標定值設(shè)為6.86，然后按開始標定鍵，待pH顯示值穩(wěn)定后可按零點標定結(jié)束鍵，然后洗凈擦干電極后同樣方法標定斜率，然后再標定零

6、點，反復(fù)至更換緩沖液時，pH未經(jīng)標定已達標準值（附近）即可。7蠕動泵流量標定 蠕動泵的標定隨時可以進行?？梢詫λ?、堿泵、補料泵、消泡劑泵進行標定，方法相同。先取定量的液體，安裝好，然后在標定畫面上設(shè)為標準容量。然后將手、自動開關(guān)調(diào)節(jié)到手動位置，使泵運轉(zhuǎn)并將管內(nèi)空氣排出開始滴液，將出口液體滴入標準容器，同時按標準開始鍵并確定，此時開始以秒為單位計數(shù)，待輸出液體到達設(shè)定的標準容量時，再按確定。整個標定過程結(jié)束。此時，加料速度便由控制器顯示出來。標定結(jié)束后將開關(guān)置于“關(guān)”的位置。8將4步驟配制好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中，加水至體積約11.5升（防止水蒸發(fā)過多）。7二、實罐滅菌操作1、準備蓋緊罐蓋上的各種

7、蓋帽，旋緊罐蓋上的壓緊螺栓，關(guān)緊發(fā)酵罐底閥P01，倒入培養(yǎng)基，調(diào)整pH值，旋緊接種口。關(guān)排氣冷凝器進水W03，移去進出口的軟管排盡冷凝水夾套中的水2、培養(yǎng)基預(yù)熱準備工作 預(yù)先啟動蒸汽發(fā)生器及空氣壓縮機。 將控制器中的溫度控制設(shè)定為手動 開排氣閥VT1，關(guān)閉其他所有閥們 開排氣閥VT1，開夾套冷凝水閥V01排夾套水，關(guān)閉其他閥門。啟動反應(yīng)器攪拌馬達。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速200-300rpm。蒸汽進夾套：緩慢開夾套蒸汽閥S01蒸汽進夾套（注意：此時有輕微爆破聲屬正常，如聲音過響，則開閥速度應(yīng)減慢）。待排水總口排出蒸汽時調(diào)節(jié)冷凝水閥V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夾套內(nèi)壓力不要超過0.2MPa

8、。當培養(yǎng)基預(yù)熱至98時，進入實罐滅菌操作。在培養(yǎng)基溫度在80-90時可以適當?shù)臏p慢升溫速度，在本溫度區(qū)域可以殺滅大部分微生物。蒸汽進取樣閥：開出料閥P02（關(guān)緊底閥P01），開蒸汽閥S03，蒸汽進入取樣閥內(nèi)腔，當閥P02 排盡冷凝水后應(yīng)調(diào)節(jié)其開度，以少量蒸汽排出即可。83、實罐滅菌蒸汽進過濾器：停攪拌，微開過濾器上排冷凝水閥V02，開過濾器前蒸汽閥S02，微開過濾器后排冷凝水閥V03，緩緩開切斷閥A03，蒸汽經(jīng)過過濾器進入反應(yīng)器，當冷凝水閥V02、V03出口冷凝水很少時，調(diào)節(jié)冷凝水閥V02、V03以有少量蒸汽排出為宜。當排氣口有蒸汽排出或罐溫到達100兩分鐘后，關(guān)閉排氣閥VT1。調(diào)節(jié)切斷閥A0

9、3和蒸汽閥S02，維持過濾器前蒸汽壓力為0.12-0.16MPa，同時必須保證切斷閥有一定開度，不得關(guān)死。當罐溫達到100時，培養(yǎng)基中的溶氧接近零，可以標定溶氧的零點。當達到預(yù)定溫度或罐壓，開排氣閥VT1至有少量蒸汽排出，關(guān)緊或微開夾套蒸汽閥S01，微開底閥P01（開閥時觀察視鏡處培養(yǎng)基翻騰的變化，以有少量變化為宜），根據(jù)罐壓或罐溫變化的趨勢。及時調(diào)節(jié)蒸汽閥S02、S03。閥門調(diào)節(jié)應(yīng)微調(diào)，避免大幅度開關(guān)。當反應(yīng)器罐壓或罐溫維持在預(yù)定的范圍內(nèi)開始計時。保溫開始后，排氣閥蒸汽排量不宜太小，否則可能導致液面以上的罐體部分尤其罐蓋達不到消毒溫度。保溫階段應(yīng)旋松接種口蓋至有少量蒸汽冒出。4、滅菌完成及降

10、溫（先開后關(guān)，后開先關(guān)）保溫結(jié)束后首先旋緊接種口蓋。旋緊罐底閥P01，再關(guān)緊取樣器的蒸汽閥S03。關(guān)緊空氣管線切斷閥A03及冷凝水閥V03，關(guān)緊過濾器前蒸汽閥，全開空氣閥A01、A02，開冷凝水閥V03用空氣吹過濾器，當罐壓接近0.05MPa時關(guān)閉閥V03，緩緩開空氣管線切斷閥A03，空氣進入發(fā)酵罐。當過濾器冷凝水閥V02排盡冷凝水后就可以關(guān)閉關(guān)夾套蒸汽閥S01、冷凝水閥V01，開夾套進水閥W01和循環(huán)管線切斷閥W02。在控制器中將溫度控制方式設(shè)定為“自動”，發(fā)酵罐進入自動降溫階段。按下攪拌開關(guān)，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速并“自動”控制。在降溫過程中，始終監(jiān)視罐壓，嚴禁壓力掉零。當溫度到達工藝要求時，調(diào)節(jié)攪

11、拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓、標定溶氧電極斜率及校正pH電極的零點。9三、接種調(diào)節(jié)進氣量至3001000L/h，開排氣閥至罐壓接近于0（不得大于0.2kg/cm3），放松接種口，在火焰保護下打開接種口，迅速將種子倒入，旋緊接種蓋，立即調(diào)高罐壓，在控制器的初始化菜單中設(shè)定發(fā)酵批號，并開始進行發(fā)酵。四、補料將滅菌消毒的補料瓶放好，手動安裝好輸液管，使中間接頭嵌在蠕動泵凹槽內(nèi)用酒精棉球擦拭罐蓋補料口，打開蓋后將針頭迅速插入并穿透密封蓋。打開蠕動泵手動開關(guān)，使料液管中充滿料液，置開關(guān)為自動。五、發(fā)酵及取樣檢測取樣器消毒：半開閥P02，開蒸汽閥S03，蒸汽進入取樣器，消毒時間5-10分鐘。關(guān)蒸汽閥S03，全開出料閥P02，準備取樣。逆時針轉(zhuǎn)動取樣閥P01手柄，進行