His標(biāo)簽融合蛋白

1、默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam1.MERCK默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam產(chǎn)品使用說明書HisTag融合蛋白純化操作手冊(cè)*建議同時(shí)參考本說明書英文原文（說明書編號(hào)TB273）。采用pET系統(tǒng)進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，蛋白的表達(dá)量達(dá)到20mg/100ml培養(yǎng)物并不是困難的事。在大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵體）、細(xì)胞定位（細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)、培養(yǎng)基上清），都會(huì)對(duì)后續(xù)的純化策略造成影響。我們建議研究者在蛋白表達(dá)后，首

2、先進(jìn)行目的蛋白的細(xì)胞定位（請(qǐng)參考pET系統(tǒng)操作手冊(cè)）；在進(jìn)行大量純化之前，小量純化蛋白，摸索確定適合丁具體蛋白的純化條件，也是值得推薦的好方法。外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，可能以可溶形式存在，也可能以包涵體形式存在。尤其在高水平表達(dá)的條件下，更容易形成包涵體。包涵體的形成與外源蛋白本身性質(zhì)、載體、宿主菌、以及表達(dá)水平都有關(guān)系，可以通過選擇不同表達(dá)載體和E.coli宿主菌組合，摸索生長(zhǎng)條件和適宜誘導(dǎo)條件，達(dá)到優(yōu)化蛋白表達(dá)的目的。HisTag融合蛋白，可以在天然條件或變性條件下用NTAHis-Bind樹脂或IDAHis-Bind樹脂進(jìn)行純化。內(nèi)容提要一、親和純化樣品的前處理菌液體積起始目的蛋白量細(xì)菌

3、裂解獲得可溶蛋白BugBusterMasterMix蛋白抽提方法機(jī)械破碎（如超聲等）二、親和純化步驟Ni-NTA樹脂純化Ni-NTA樹脂的兼容性天然條件純化柱層析FPLC批次小量純化變性條件的純化柱層析FPLC純化批次小量純化樹脂再生常見問題與改善建議附錄：補(bǔ)充背景知識(shí)雜蛋白如何降低非特異性結(jié)合漂洗雜蛋白目的蛋白的洗脫純化真核表達(dá)體系來源的雜蛋白如何降低非特異性結(jié)合漂洗雜蛋白目的蛋白的洗脫純化真核表達(dá)體系來源的His-Tag融合蛋白His-Tag融合標(biāo)簽的去除推存資料His-Bind基質(zhì)選擇指南在確定裂解方法前的考慮蛋白可溶性及細(xì)胞定位天然或變性條件下目的蛋白的純化批次小量純化或柱層析純化方法

4、日的蛋白的結(jié)合一、親和純化樣品的前處理1.MERCKit菌液體積起始目的蛋白量1.MERCKit純化條件的優(yōu)化需考慮多個(gè)因素，包括His-Tag融介蛋白表達(dá)水平和上樣量。若目的蛋白未能髙效表達(dá)，需要采用一個(gè)較高的濃縮系數(shù)（concentrationfactor）進(jìn)行菌的裂解，即在較大培養(yǎng)體系中，按一怎比例加入一宦體積的裂解/結(jié)合緩沖液。濃縮系數(shù)定義為菌液體積與裂解/結(jié)合緩沖液體積之比。不同日的蛋白表達(dá)水平推薦使用的裂解/結(jié)合緩沖液體積、對(duì)應(yīng)的濃縮系數(shù)大小，請(qǐng)參考表1例如，某蛋白表達(dá)水平約為0.1mg/ml,需要在變性條件下進(jìn)行小批提純，貝0100ml的培養(yǎng)物離心獲得的菌體，按濃縮100倍比例重

5、懸于含變性劑的1ml裂解/結(jié)合緩沖液中。在非變性條件下進(jìn)行純化時(shí)，要準(zhǔn)確預(yù)計(jì)裂解液中可溶蛋白的含量比較困難，一般建議采用50-100倍濃縮。表1確定所需菌液體積HisTag融合蛋白濃度表達(dá)水平培養(yǎng)體積HisTag融合蛋白總量濃縮系數(shù)（在1ml溶液中裂解后）變性條件50mg/L40%3ml150pg3X10mg/L8%10ml100pg10X2mg/L1.6%25ml50pg25X0.5mg/L0.4%50ml25pg50X0.1mg/L0.8%100mlWg100X天然條件1mg/L1%50ml50g50X1mg/L1%100ml100g100X與其它親和純化介質(zhì)一樣.His-Bind樹脂在接

6、近其結(jié)合載雖時(shí)使用，可以獲得最好蛋白分離效果。所以在蛋白純化前估計(jì)細(xì)菌抽提物中目的筑白的含靈有利丁確定上樣雖、選擇合適體積的親和樹脂或預(yù)裝柱。SDS,Westernblot,S-TagRapidAssay,FRETWorksS-TagAssay等方法都可用丁確定抽提物中|:|的蛋白的含雖。細(xì)菌裂解獲得可溶蛋白BugBusterMasterMix蛋白抽提方法BugBusterMasterMix（貨號(hào)71456）是將BugBuster蛋白抽提試劑，Benzonase核酸fiflirLysozyme溶菌卿溶液按最優(yōu)化配比混合好的一種非常方便使用的蛋白抽提試劑，有助于在最優(yōu)化條件下獲得可溶活性蛋白。這

7、種預(yù)混形式的試劑減少了稀釋試劑、計(jì)算各種試劑使用量和分別添加的麻煩。100ml和500ml包裝分別足夠用于20g和100g細(xì)胞沉淀的可溶蛋白抽提?？扇艿鞍字苽洳捎么瞬僮鞒樘岬降牡鞍装▉碜约?xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的可溶蛋白。如果欲僅收集周質(zhì)部分蛋白，可以參考Novagen的TB055“PET系統(tǒng)操作手冊(cè)”中提到的滲壓休克方法或其它合適的方法。滲透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以獲得細(xì)胞質(zhì)中的可溶蛋白。用經(jīng)預(yù)先稱重的離心管105000g離心10分鐘從液體培養(yǎng)體系收集細(xì)胞。如果是小規(guī)模培養(yǎng)（如15ml或更少）,可以用15ml離心管14,000-16,000g離心。盡量?jī)A去液體，稱雖細(xì)胞沉淀濕重。室

8、溫下用吸打或溫和渦旋使BugBusterMasterMix與細(xì)胞沉淀混勻，每克細(xì)胞糊需要5ml抽提試劑。這相當(dāng)于50ml培養(yǎng)液采用2.5ml抽提試劑。如果是小規(guī)模培養(yǎng)，則采用約1/5培養(yǎng)體積的抽提試劑重懸沉淀（例如，1.5ml培養(yǎng)液采用300川抽提試劑）如果抽提試劑過量也沒有什么副作用。選做，加蛋白齣抑制劑。BugBusterMasterMix與蛋白齣抑制劑兼容。如果目的蛋白后續(xù)要用凝血齣（貨號(hào)69671）,Xa岡子（貨號(hào)69036）或重組腸激酶（貨號(hào)69066）處理，就應(yīng)該避免使用絲氨酸蛋白齣抑制劑。盡管純化過程可能去除活性抑制劑，建議在齣切前最好做透析或凝膠過濾。室溫下將重懸的細(xì)胞液在搖板

9、或低速攪拌器上孵育1020分鐘。注意:孵育后獲得的抽提物不是粘稠的。4C下16：000g離心20分鐘以去除不溶的細(xì)胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵體純化”（見以下說明）的材料。將上淸轉(zhuǎn)入另一個(gè)新試管。這樣抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上樣于Novagen的純化樹脂（以及其它很多類似純化系統(tǒng)）蛋白溶液在冰上可以短時(shí)存放（23小時(shí)），也可在20C長(zhǎng)時(shí)間存放直至下步分析。蛋白抽提液應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的活性要求的溫度存放，有些蛋白經(jīng)凍融會(huì)失活。1.MERCK高純度包涵體的制備11以下操作可用于任何BugBuster系列產(chǎn)品抽提的包涵體純化。如可溶蛋白抽提步驟4進(jìn)行操作。將步驟“4”所得到的沉淀重懸于

10、BugBuster（貨號(hào)70584）,BugBuster的量與當(dāng)初重懸細(xì)胞糊的體積相同。吸打并渦旋以獲得均勻的懸浮液。充分重懸沉淀能夠溶解.去除雜蛋白以獲得高純度的包涵體。加入rLysozyme溶液至終濃度7j1KU/mL溫和渦旋混勻，室溫孵育5分鐘。注意:如果采用的是BugBusterMasterMix就不需要另加rLysozyme了（即可省去此步操作）。加入6倍體積的經(jīng)1:10去離子水稀釋的BugBusterM懸，渦旋1分鐘混勻。于45,000g離心15分鐘，以吸管移去上淸，收集包涵體。將包涵體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)體系體積一半的經(jīng)1:10稀釋的BugBuster中，渦旋混勻，如步驟5離心。此

11、步驟重復(fù)兩次。再次重懸，于4C,16,000g離心15分鐘并去除上淸。重懸最終的沉淀（即純化的包涵體）于選怎的緩沖液，最好是能與后續(xù)純化方法兼容的緩沖液。包涵體可以重懸于Novagen的蛋白重折疊試劑盒（貨號(hào)70123）中的1X溶解緩沖液（參考操作手冊(cè)TB234）或其它變性劑。不溶的HisTag融合蛋白可以用含有變性劑的1X結(jié)合緩沖液重懸用于His-Bindm化（IDA或NTA）機(jī)械破碎（如超聲等）可溶蛋白的制備稀釋8X儲(chǔ)液制成1X結(jié)合緩沖液，或按照緩沖液成分列表自己配制（參考NovagenI3錄或樹脂英文說明書）10:000g離心10分鐘收集菌體。棄上淸，盡量去除培養(yǎng)基。按每100ml培養(yǎng)基

12、所得菌體加入4ml（1:25v/v）緩沖液，重懸于冰浴預(yù)冷的1X結(jié)合緩沖液或1XFractogel結(jié)合緩沖液中。也可加入NP-40或其他非離子型去污劑至終濃度0.1%,以減少非特異性結(jié)合。若細(xì)菌菌體重懸困難，可使用勻漿器、攪拌器或超聲儀幫助打散菌體。將重懸菌液置于合適大小的容器中，超聲破碎。超聲過程中保持菌液處于冰浴或鹽冰浴中。超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率、探頭種類、容器的大小形狀，須實(shí)驗(yàn)者自己摸索。應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，可分成短時(shí)間、多次超聲。通過一左的間隔時(shí)間避免溶液過熱。若DNA未能被超聲剪切，裂解液會(huì)I分粘稠，可能阻塞色譜柱，降低流速，彩響后續(xù)的純化過程。大量的菌體可選用弗

13、氏壓碎法（FrenchPress）.可選做：100mM)可以將HisTag融介蛋白從Ni-NTAHisBind樹脂上洗脫下來其它添加劑NaCI甘油乙醇咪陞碳酸氫鈉血紅蛋白檸檬酸鹽防止離子間相互作用防止蛋白間的疏水作用防止蛋白間的疏水作用與HisTag中的組毎酸殘基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ni-NTA濃度可達(dá)2M,使用時(shí)濃度至少為150mM濃度可達(dá)50%濃度可達(dá)20%低濃度(20mM)使用時(shí)可以阻止非特異性結(jié)合，高濃度(100mM)可以將HisTag融介蛋白從Ni-NTAHisBind樹脂上洗脫下來不推薦不推薦不推薦有使用濃度60mM的成功實(shí)例.MERCKII2.天然條件純化在決定使用天然條件（非變性條件）進(jìn)行

14、蛋白純化之前，首先需要確定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不溶形式表達(dá)，仍有可能有少量可溶蛋白可以用NiNTAHisBind樹脂純化出來。在沒有強(qiáng)變性劑如尿素的情況下，細(xì)胞裂解物中部分不穩(wěn)定的蛋白可能容易被降解。最好始終保持蛋白溶液處于低溫04C,并快速操作。加入AEBSF或蛋白酶抑制劑混合物系列川貨號(hào)101500和539134）,可能幫助蛋白穩(wěn)定（視具體情況而定），但是需要考慮到它們對(duì)重組蛋白的可能影響。天然條件純化所需緩沖液（試劑盒70899）1XNI-NTA結(jié)合緩沖液：（用于裂解和結(jié)合步驟）50mMNaH2PO4pH8.0,300mMNaCI,伽M咪啡（加入1/10體積的WXBugBu

15、ster或溶菌酶能獲得更好裂解效果。參見前述“制備細(xì)菌裂解物”部分）iXNi-NTA漂洗緩沖液：50mMNaH2P04pH8.0,300mMNaCL20mM咪哇iXNi-NTA洗脫緩沖液:50mMNaH2PO4,pH8.0,300mMNaCI,250mM咪哇柱層析需要破碎多少菌體根據(jù)所使用的表達(dá)體系和HisTag融合蛋白的表達(dá)水平來決定。Ni-NTAHis-Bind樹脂與不同His-Tag融合蛋白的結(jié)合能力不同，通常為5-10mg/mL如Ni-NTAHis-Bind樹脂或Ni-NTAHis-BindSuperflow對(duì)HisTagDHFR（26kDa）的結(jié)合量為03pmol/ml（8.0mg/

16、ml）。請(qǐng)參考表1“如何確定所需菌液體積”。對(duì)于高表達(dá)水平的口的蛋白（每升培養(yǎng)基10-50mgHis-Tag融合蛋白），可用10倍濃縮的細(xì)菌裂解物。4ml10倍濃縮的裂解物含有約0.4-2mg的HisTag融合蛋白。對(duì)于低表達(dá)水平的蛋白（15mg/l培養(yǎng)基），可以50倍濃縮，抽提200ml菌液，獲得4ml的細(xì)菌裂解物（4ml細(xì)菌裂解物=0.2-1mgHis-Tag融合蛋白）。IXNi-NTA結(jié)合緩沖液包含10mM咪I吐，用于降低雜蛋白與樹脂的非特異性結(jié)合，減少所需漂洗步驟，獲得更高目的蛋白純度。若His-Tag融合蛋白在此條件下無法結(jié)合到柱上，咪i邛的濃度可以降低至1-5mMe許多His-Ta

17、g融合蛋白對(duì)N有更高結(jié)合力，這種情況下結(jié)合緩沖液中的咪哇濃度可以增加到20mM.實(shí)驗(yàn)材料從40-200ml菌液制備而得的澄淸裂解液NiNTAHisBind樹脂（貨號(hào)70666）空色譜柱（貨號(hào)69673）IXNi-NTA結(jié)合緩沖液IXNi-NTA漂洗緩沖液1XNi-NTA洗脫緩沖液Ni-NTA緩沖液試劑盒（貨號(hào)70899-3）提供各種緩沖液的濃縮儲(chǔ)液。仁將1ml50%Ni-NTAHis-Bind樹脂懸液加入到4mllxNi-NTA結(jié)合緩沖液中,輕柔混勻。待樹脂自然沉降后，用槍頭吸去4ml上淸。2、加入4ml制備好的裂解液，輕柔搖動(dòng)棍勻（旋轉(zhuǎn)混介器，200rpm）,4C結(jié)合60分鐘。3、將裂解液N

18、i-NTAHis-Bind樹脂混介物加入下端封閉的空色譜柱中。4、除去柱下端封閉蓋子，收集流出液（穿過峰），保存用于SDS電泳分析。5、以4ml1XNi-NTA漂洗緩沖液漂洗2次，收集漂洗組分，用于SDS電泳分析。6、以0.5ml1XNi-NTA洗脫緩沖液洗脫目的蛋白4次。將洗脫組分分為四部分收集，并走SDS電泳分析齊保存組分。1XNi-NTA結(jié)合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液的成分可以根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整以滿足實(shí)驗(yàn)者的具體需要，如加入0.1%Tween、5-1OmMB-基乙醇、蛋白胸抑制劑混合物系列III、增加NaCI或|汕濃度等。樹脂的試劑兼容性請(qǐng)參考表2。FPLC若需純化大量蛋白，可以使

19、用FPLC設(shè)備，需配合Ni-NTAHis-BindSuperflow柱使用。Ni-NTAHis-BindSuperflow的物理穩(wěn)宦性使其適用于較高壓力和流速的層析方式。實(shí)驗(yàn)材料從40-200ml菌液制備而得的澄淸裂解液Ni-NTAHisBindSuperflow（貨號(hào)70691）IXNi-NTA結(jié)合緩沖液（緩沖液試劑盒貨號(hào)70899）IXNi-NTA漂洗緩沖液1XNI-NTA洗脫緩沖液FPLC設(shè)備仁按FPLC設(shè)備的安裝要求，裝好色譜柱。去除色譜柱的上端接頭，關(guān)上柱下端開關(guān)。.MERCKII2、徹底重懸體積比為50%的Ni-NTAHis-BindSupertlow.MERCKII注意避免產(chǎn)生氣

20、泡。通過一根細(xì)玻棒，小心緩慢將樹脂懸液加入空柱中。所需空色譜柱大小和樹脂體積由待純化的His融合蛋白總量決定。一般來說,Ni-NTAHisBindSuperflow的載量為每ml樹脂5-1Omg蛋白。3、使樹脂沉降。通過打開柱下方蓋子，使緩沖液流動(dòng)，可以加快樹脂沉降過程。也可根據(jù)具體需要使用蠕動(dòng)泵，但流速不可超過2ml/mino請(qǐng)注意避免緩沖液流干。若發(fā)生這種情況，用裂解緩沖液重懸樹脂并重新裝柱。在樹脂完全沉降前，可以加入更多樹脂懸液以增加柱床體積。4、加入上端接頭，調(diào)整至沉降樹脂上端。避免引入任何氣泡。裝好的色譜柱可以接入FPLC系統(tǒng)流路中。5、以5倍床體積1XNiNTA結(jié)合緩沖液平衡色譜柱

21、。流速不可超過2ml/mino280nm紫外監(jiān)控.當(dāng)用5倍床體積緩沖液平衡后，基線應(yīng)穩(wěn)定。6、上樣，以1XNi-NTA結(jié)合緩沖液漂洗至A280穩(wěn)定。通常50倍體積緩沖液即足夠。這一步驟中諳注意系統(tǒng)壓力。若樣品很粘稠，壓力可能超過建議值（10bar）0可降低流速至0.5-1ml/mino若His融合蛋白未結(jié)合，可進(jìn)一步降低流速。在蛋白洗脫步驟時(shí)可以加大流速。收集流岀組分，以備SDS電泳分析。7、以1xNiNTA漂洗緩沖液漂洗至A28o至基線。通常5-10倍體積緩沖液即足夠。收集流出組分用于SDS電泳分析。&以1XNi-NTA洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。根據(jù)需要可釆用梯度洗脫。每個(gè)洗脫梯度（咪吐濃度梯

22、度可以通過將洗脫緩沖液與漂洗緩沖液按一定體積比例混合獲得）通常5-10倍體積緩沖液即足夠。HisTag融合蛋白一般在第二.第三個(gè)柱體積時(shí)洗脫下來。注慮：咪I堆280nm時(shí)也有光吸收，若只有小His融合蛋白洗脫，蛋白吸收蜂受咪醴影響不易看出。批次小量純化實(shí)驗(yàn)材料小離心管溶菌酶（貨號(hào)71110）Ni-NTAHisBind樹脂（貨號(hào)70666）1XNI-NTA結(jié)合緩沖液（緩沖液試劑盒貨號(hào)70899）1XNI-NTA漂洗緩沖液1XNI-NTA洗脫緩沖液仁取1ml菌液，加入一個(gè)小離心管中。需要破碎多少菌體依賴于目的蛋白的表達(dá)水平。若蛋白髙水平表達(dá)，1ml菌液所含目的蛋白就足夠了（參考表1）o若蛋白表達(dá)水

23、平低，可能需要更大體積的菌液。若需要檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)水平的彫響，每隔30分鐘從培養(yǎng)體系中取出1ml菌液，離心收集菌體,-20C保存，直至所有樣品收集完全。2、15,000g離心1分鐘，收集菌體,棄上淸。若需要更大體積的菌液，可向離心后去除上淸的離心管中再加入菌液，再次離心，從而獲得更多菌體。3、將細(xì)胞沉淀在-20C冷凍15-20mino4、將細(xì)胞完全解凍，用100uI1XNi-NTA結(jié)合緩沖液重懸菌體。若僅取1ml菌液，濃縮系數(shù)為10,對(duì)于某些需要在天然條件下純化的蛋白來說可能不夠，諳參考表仁5、加入溶菌酶4.5-6KU30度孵育15mir）o6、輕柔渦旋，裂解細(xì)胞，避免起泡?？蛇x做

24、：每100ul重懸細(xì)胞加入2.5uBenzonase核酸酶。可將Benzonase稀釋10倍（2.5u/ul）以方便取用（稀釋緩沖液請(qǐng)垂詢）7、裂解物15,000g離心10mino除去細(xì)胞不溶殘片，上淸轉(zhuǎn)入干凈小管中8、每管加入20uI50%Ni-NTAHis-Bind樹脂懸液（相當(dāng)于10ul樹脂，可結(jié)合50-100ugHisTag融合蛋白）,4C輕柔混勻，結(jié)合30分鐘。9、15,000g離心10s沉淀樹脂，取10ul上清轉(zhuǎn)入另一干凈小管中，以備電泳分析。棄去其它上淸。上淸留樣保存于冰上。上淸樣品包含無法與樹脂結(jié)合的蛋白。10、用100ul1XNI-NTA漂洗緩沖液漂洗樹脂2次。每次漂洗步驟包

25、括15,000g離心10秒，小心吸去上淸。1仁用20nI1XNi-NTA洗脫緩沖液洗脫目的蛋白3次。每次洗脫步驟包括15,000g離心10秒，小心將上淸轉(zhuǎn)移至干凈小管中。12、SDS分析第8步（未結(jié)合組分）和第10步洗脫組分。.MERCKII變性條件的純化.MERCKII變性條件純化所需緩沖液變性裂解/結(jié)合緩沖液BufferA：6MGu-HCh0.1MNaH2P04；0.01MTris-CI,pH8.0BufferB：8M尿素;0.1MNaH2P04：0.01MTris-CbpH8.0變性漂洗緩沖液BufferC：8M尿素;0.1MNaH2P04；0.01MTris-CIpH6.3變性洗脫緩沖

26、液BufferD：8M尿素;0.1MNaH2P04；0.01MTris-CIpH5.9BufferE：8M尿素;0.1MNaH2P04；0.01MTris-CIpH4.5注意：BufferB.C、D、E應(yīng)在使用前調(diào)至適宜pH值，以避免尿素解離。柱層析實(shí)驗(yàn)材料變性裂解/結(jié)合緩沖液裂解制備的細(xì)菌裂解物（20200ml菌液體積）。Ni-NTAHisBind樹脂（貨號(hào)70666）空色譜柱（貨號(hào)69673）BuffersAE1、將1ml50%Ni-NTAHis-Bind樹脂懸液加到4ml細(xì)胞裂解液中，輕柔混勻（如旋轉(zhuǎn)混合器200rpm）,室溫結(jié)合1560min需要破碎多少菌體根據(jù)所使用的表達(dá)體系和His

27、Tag融合蛋白的表達(dá)水平。Ni-NTAHisBind樹脂與不同的His-Tag融合蛋白的結(jié)合能力不同，通常為5-10mg/ml。如NiNTAHisBind樹脂或Ni-NTAHisBindSuperflow對(duì)HisTagDHFR（26kDa）的結(jié)合量為0.3nmol/ml（8.0mg/ml）0諳參考表1。對(duì)于高表達(dá)水平的口的蛋白（每升培養(yǎng)基50-1OOmgHisTag融合蛋白），可用5倍濃縮的細(xì)菌裂解物（如20ml菌液離心獲得的菌體重懸于4mlBufferB）4ml5倍濃縮的裂解物含有約1-2mg的HisTag融合蛋白。對(duì)于低表達(dá)水平的蛋白（培養(yǎng)基），可以50倍濃縮，抽提200ml菌液，獲得4m

28、l的細(xì)菌裂解物（4ml細(xì)菌裂解物=021mgHisTag融合蛋白）。2、將裂解液與Ni-NTAHisBind樹脂的混合物小心加入下端封閉的空色譜柱中。3、除去柱下端封閉蓋子，收集流出液（穿過峰），保存用于SDS電泳分析。4、以4mlbufferC漂洗雜蛋白2次。保存漂洗組分用于SDS電泳分析。5、以0.5mlbufferD洗脫目的蛋白4次,再以0.5mlbufferE洗4次,收集組分，用SDS分析。蛋白單體通常用bufferD即可洗脫，而多聚體.聚合物和含兩個(gè)HisTag標(biāo)簽的蛋白通常由bufferE洗脫。FPLC純化若需純化大量蛋白，可以使用FPLC設(shè)備，需配合Ni-NTAHis-BindS

29、uperflow柱（貨號(hào)70691）使用。Ni-NTAHisBindSuperflow的物理穩(wěn)定性使其適用于較高壓力和流速的層析方式。實(shí)驗(yàn)材料變性裂解/結(jié)合緩沖液制備的澄清裂解液Ni-NTAHisBindSuperflow（貨號(hào)70691）BuffersA-EFPLC設(shè)備1、按FPLC設(shè)備的安裝要求，裝好色譜柱。去除色譜柱的上端接頭并將柱下端封閉。2、徹底重懸一宦體積50%Ni-NTAHisBindSuperflow樹脂懸液，倒入空柱中。注意避免產(chǎn)生氣泡。通過一根細(xì)玻棒，小心緩慢將樹脂懸液加入空柱中。所需空色譜柱大小和樹脂體積由待純化的HisTag融合蛋白總量決定。一般來說，Ni-NTAHis

30、BindSuperflow的載量為每ml樹脂5-10mg蛋白。3、使樹脂沉降。通過打開柱下方蓋子，使緩沖液流動(dòng)，可以加快樹脂沉降過程。也可根據(jù)具體需要使用端動(dòng)泵，但流速不可超過2ml/mim請(qǐng)注意避免緩沖液流干。若發(fā)生這種情況，用裂解緩沖液重懸樹脂并重新裝柱。在樹脂完全沉降前，可以加入更多樹脂懸液以增加林床體積。4、加入上端接頭，調(diào)整至沉降樹脂上端。避免引入任何氣泡。裝好的色譜柱可以接入FPLC系統(tǒng)流路中。5、以5倍床體積bufferB平衡色譜柱。280nm紫外監(jiān)控，當(dāng)用5倍床體積緩沖液平衡后，基線應(yīng)穩(wěn)定。.MERCKII6、上樣，以bufferB洗至理80低于0.01,通常510.MERCK

31、II開始時(shí)控制流速在1ml/min注意系統(tǒng)壓力。若樣品很粘稠,壓力可能超過建議值dObar）。也可根據(jù)需要降低流速。收集流出組分，以備SDS電泳分析。7、以bufferC漂洗至A28o小于0.01o通常510倍體積緩沖液即足夠。BufferC洗脫與樹脂非特異性結(jié)合的組分，收集流出組分用于SDS電泳分析。8、以bufferD或bufferE洗脫目的蛋白。若使用bufferD無法完全洗脫目的蛋白，可以使用bufferE0蛋白單體通常用bufferD即可洗脫，而多聚體、聚合物和含兩個(gè)HisTag標(biāo)簽的蛋白通常由bufferE洗脫。一般5個(gè)柱體積的緩沖液即可充分洗脫蛋白。His-Tag融介蛋白通常在第

32、二、第三個(gè)柱體積時(shí)出峰。批次小量純化實(shí)驗(yàn)材料小離心管Ni-NTAHisBind樹脂（貨號(hào)70666）BuffersA,B,C,E1、取1ml菌液加入一個(gè)小離心管中需要破碎多少菌體依賴于日的蛋白的表達(dá)水平。若蛋白髙水平表達(dá)，1ml菌液所含目的蛋白就足夠了（參考表1）o若蛋白表達(dá)水平低，可能需要更大體積的菌液。若需要檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響，每隔30分鐘從培養(yǎng)體系中取出1ml菌液，離心收集菌體，一20C保存，直至所有樣品收集完全。2、15,000g離心1min,收集菌體，棄上淸。若需要更大體積的菌液，可向離心后去除上淸的離心管中再加入菌液，再次離心，從而獲得更多菌體。3、以200nIB

33、ufferB重懸菌體。輕柔渦旋裂解細(xì)胞，避免起泡。裂解完全后，溶液變?yōu)榘胪该鳡顟B(tài)。多數(shù)蛋白在BufferB中可溶。若溶液無法變透明，以bufferA裂解細(xì)胞。4、15,000g離心10min,除去細(xì)胞不溶殘片，上淸轉(zhuǎn)入干凈小管中。5、每管加入50uI50%Ni-NTAHisBind樹脂懸液（相當(dāng)于25uI樹脂，可結(jié)合125-250ugHisTag融合蛋白）,輕柔混勻，室溫結(jié)合30min6、15,000g離心10s沉淀樹脂，取10uI上淸轉(zhuǎn)入另一干凈小管中，以備電泳分析，棄去其它上淸。上淸留樣保存于冰上。上淸樣品包含無法與樹脂結(jié)合的蛋白。7、以250uIbufferC漂洗樹脂2次。每次漂洗步驟包

34、括15,000g離心10s,小心吸去上清。&以25uIbufferE洗脫目的蛋白3次。每次洗脫步驟包括15,000g離心10s,小心將上淸轉(zhuǎn)移至干凈小管中。9、SDS電泳分析各組分。若使用bufferA裂解菌體，含鹽酸丿呱的樣品需要事先處理方能用于SDS電泳上樣。含弧樣品進(jìn)行SDS電泳前的處理由于含鹽酸肌的樣品在用SDS處理時(shí)會(huì)形成沉淀，在進(jìn)行SD&PAGE電泳前，樣品須用水稀釋（1:6稀釋），或透析.或采用TCA沉淀除去鹽酸呱TCA沉淀仁將10-25uI蛋白樣品用水稀釋到10Oul2、加入100ul10%TCA3、冰浴20分鐘；小離心機(jī)離心15min4、以100ul預(yù)冷乙醇洗滌沉淀，干燥沉淀

35、，以電泳上樣緩沖液重懸。若還有少量鹽酸肌存在，樣品必須在95C加熱7分鐘后，迅速上樣。丄/.,丄/，丄么丄/丄/.,丄/，丄么丄/，丄/.,丄丄/.,丄么丄/,1234567891需需需需需需需需需幕a-ba-ba-ba-ba-ba-ba-ba-ba-hNi-NTAHis-Bind樹脂能否反復(fù)使用主要取決于樣品的特性，只能在純化同一種重組蛋白是樹脂才可以反復(fù)使用。建議樹脂再生不超過5次。如果Ni-NTA樹脂由淺藍(lán)色變?yōu)樽鼗疑蛻?yīng)該采用以下方法對(duì)樹脂進(jìn)行再生處理了。采用以下步驟洗柱：1倍體積即柱床體積。2倍體積再生緩沖液（6MGU-HCI,0.2M醋酸）5倍體積水3倍體積2%SDS1倍體積25%

36、乙醇1倍體積50%乙醇1倍體積75%乙醇5倍體積100%乙醇1倍體積75%乙醇1倍體積50%乙醇1倍體積25%乙醇.MERCKII第11步1.MERCKII第12步5倍體積WOmMEDTA,pH8.0第13步10倍體積水第14步2倍體積100mMNiS04第15步2倍體積水第16步2倍體積再生緩沖液第17步2倍體積適合的緩沖液平衡（例如1XNLNTA結(jié)合緩沖液，bufferA或bufferB）II5.常見問題與改善建議.MERCK5.常見問題與改善建議II現(xiàn)象可能原因建議蛋白無法與Ni-NTAHisBind樹脂結(jié)合目的蛋白無HisTag序列測(cè)序以確怎連接處序列和閱讀框是否正確。檢査是否存在內(nèi)部

37、翻譯起始位點(diǎn)（若HisTag序列構(gòu)建于目的蛋白N端），或翻譯提前終止（若HisTag序列構(gòu)建于目的蛋白C端）HisTag序列空間難以接近變性條件下純化蛋白；或?qū)isTag序列構(gòu)建于目的蛋白另一末端HisTag序列已被降解檢査穿過組分中有無帶有HisTag的片段結(jié)合條件不對(duì)檢査所有溶液的pH值和組成成分尿素的解離常導(dǎo)致pH值的變化。應(yīng)在使用之前測(cè)左緩沖液pH值，迅速投入使用確保體系中沒有瓷合劑和還原劑存在：咪哇的濃度太高也會(huì)導(dǎo)致蛋白不能與樹脂結(jié)合目的蛋白在漂洗步驟提前被洗出洗脫條件過于嚴(yán)格降低咪1坐濃度，或增加緩沖液pH值HisTag標(biāo)簽被部分隱藏/屏蔽降低洗脫條件的嚴(yán)格程度。變性條件下純化目

38、的蛋白緩沖液條件不正確檢査漂洗緩沖液的pH值和組成確保體系中不含軟合劑及還原劑蛋白在純化過程中形成沉淀溫度過低改為室溫純化蛋白形成聚合物嘗試加入增加溶解度的試劑,如0.1%TritonX-100或Tween-20,髙達(dá)10mM3-ME或1mMTHP,高達(dá)2MNaCI,或幫助穩(wěn)定蛋白的因子，如Mg2。某些情況下，可能需要在純化過程所有緩沖液中加入這些成分以保持蛋白的可溶性目的蛋白無法洗脫洗脫條件太溫和（蛋白可能以聚合物或多聚體形式存在）以pH梯度或咪I坐梯度洗脫，確定最佳洗脫條件蛋白洗脫時(shí)在柱中沉淀變性條件下進(jìn)行洗脫。以在離心管中結(jié)合、洗脫的小量批次方式進(jìn)行純化，以避免局部蛋白濃度過高目的蛋白與

39、雜蛋白一起洗脫出來結(jié)合和漂洗緩沖液的條件不夠嚴(yán)格在結(jié)合和漂洗緩沖液中加入10-20mM咪啤色譜柱載量相對(duì)過大減少Ni-NTAHisBind樹脂或Ni-IDAHisBind樹脂用量雜蛋白與目的蛋白結(jié)合，共純化下來加入10mM或THP以避免雜蛋白與目的蛋白之間形成二硫鍵加大漂洗緩沖液的鹽濃度，或增加去污劑濃度，加入乙醇/|汕以破壞蛋白之間的疏水作用雜蛋白是日的蛋白不完整產(chǎn)物檢査是否存在可能的內(nèi)部翻譯起始位點(diǎn)（若HisTag序列構(gòu)建于目的蛋白C端），或翻譯提前終止（若HisTag序列構(gòu)建于目的蛋白N端）避免目的蛋白在純化過程中降解，如保持在4C進(jìn)行操作，使用蛋白卿抑制劑等。樹脂變色Ni離子流失或被還

40、原確保體系中無螯合劑（Ni離子被螯合掉之后，樹脂變白色）或還原劑（樹脂變棕色）附錄：補(bǔ)充背景知識(shí)1.MERCK附錄：補(bǔ)充背景知識(shí)NTA和IDA化學(xué)基團(tuán)使用His-Tag/可根據(jù)作為His-Tag序列的組氨酸與固定化金屬離子（通常為Ni?域Cu2+）的親和力來進(jìn)行純化。金屬螯介到固相支持物共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)上。最常用的螯介物包括氮川乙酸（NTA）和亞氨二乙酸（IDA）,它們分別具有四個(gè)和三個(gè)與金屬離子相互作用的位點(diǎn)。在天然和變性條件下，這兩種化學(xué)基團(tuán)的親和介質(zhì)以及其目標(biāo)蛋白的結(jié)合、洗滌和洗脫條件的特性不盡相同。實(shí)際應(yīng)用中，NTA因多一個(gè)螯合位點(diǎn)，使純化過程中金屬浸出最小，并與還原二硫的20mM

41、B-兢基乙醇相容。緩沖液中存在其它螯合或還原成分時(shí)，由于IDA樹脂金屬浸出率高而純化結(jié)果通常不夠好。然而，IDA介質(zhì)可以循環(huán)使用兒百次而性能基本保持不變。對(duì)于不同介質(zhì)，可以通過改變條件優(yōu)化，從而使目的蛋白的純化效果達(dá)到最佳。最為常見的優(yōu)化方法是通過調(diào)整天然條件下洗滌和洗脫緩沖液的咪吐濃度，盡量減少非特異結(jié)合蛋白的共純化。His-Bind基質(zhì)選擇指南產(chǎn)品類型載量特點(diǎn)應(yīng)用Ni-NTAHis.Bindresin帶Ni的NTA瓊脂糖5-10mg/ml最小的N產(chǎn)浸出與20mMp-ME相容小到中量重力流柱推薦用于真核抽提物Ni-NTAHis.BindSuperflow帶Ni的NTA超流速瓊脂糖5-10mg

42、/ml最小的Ni浸出與20mMp-ME相容耐高流速與壓力小量到生產(chǎn)級(jí)FPLC或重力流柱推薦用于真核抽提物His.BindResin無Ni的IDA瓊脂糖8mg/ml可重復(fù)使用多次與His.Bind緩沖試劑盒兼容小到中量重力流柱或批次模式His.BindCloumn帶Ni的IDA瓊脂糖1.25ml預(yù)裝柱10mg/次預(yù)裝柱與His.BindQuick緩沖試劑盒兼容方便的純化重力流柱His.BindFractogel(M)無Ni的IDAFractogel觸須10-30mg/ml與ImMTHP兼容40-90pm顆粒大小耐高流速與壓力小量到生產(chǎn)級(jí)FPLC或重力流柱His.BindQuick300Cartr

43、idge帶Ni的IDA纖維素預(yù)裝筒0.5mg/次每端鎖緊接口與His.BindQuick緩沖試劑盒兼容注射器操作真空岐管操作快速純化His.BindQuick900Cartridge帶Ni的IDA纖維素預(yù)裝筒2mg/次每端鎖緊接口與His.BindQuick緩沖試劑盒兼容注射器操作真空岐管操作快速純化His.BindQuickCloumn帶Ni的IDA纖維素預(yù)裝柱5mg/次每端鎖緊接口與His.BindQuick緩沖試劑盒兼容真空岐管操作快速純化多個(gè)樣品His.BindMagneticAgaroseBeads帶Ni的IDA磁性瓊脂糖5mg/ml3pm磁性瓊脂糖珠子與ImMTHP兼容快速小量純化

44、磁性分離適合高通量操作協(xié)若需了解關(guān)于各種融介蛋白純化用樹脂和預(yù)裝柱更詳細(xì)的資料請(qǐng)參考默克生化印制的蛋白質(zhì)組研究工具產(chǎn)品手冊(cè)和Novagen原版目錄。F其它親和純化介質(zhì)一樣，His.Bind樹脂在接近其結(jié)合載量時(shí)使用，可以獲得最好蛋白分離效果。所以在蛋白純化詢佔(zhàn)計(jì)細(xì)菌抽提物中目的蛋白的含晝有利于確定上樣量、選擇合適體積的親和樹脂或預(yù)裝柱。SDS,Westernblot,S-TagRapidAssay,FRETWorksS-TagAssay等方法都可用于確怎抽提物中的目的蛋白的含量。在His-Tag/GST-Tag融介蛋白純化和檢測(cè)產(chǎn)品使用說明書中，也可以找到相應(yīng)的推存產(chǎn)品。在確定裂解方法前的考慮

45、：是選用機(jī)械破碎方法，還是選用PopCullure或BugBuster試劑，配合Lysonase或Benzonase核酸齣以及rLysozyme溶液用于可溶蛋白，包涵體抽提以避免機(jī)械破碎對(duì)目的蛋白的破壞。若目的蛋白需要還原環(huán)境保護(hù)，可使用0.5MTHP溶液（貨號(hào)71194）OTHPTris（hydroxypropyl）phosphlne為水溶性.無嗅的中性還原劑，比疏基乙醇更為穩(wěn)定和高效,更耐空氣氧化，I.OmMTHP可與His-Bind樹脂兼容。請(qǐng)注意使用His-Bind樹脂時(shí)緩沖液中應(yīng)避免使用B疏基乙醇DTT和EDTA.還原劑會(huì)與N產(chǎn)反應(yīng)生成棕色沉淀物。EDTA會(huì)螫合Ni匕將其從樹脂上剝離

46、下來。.MERCKII若需要，可在緩沖液中加入蛋白卿抑制劑防止蛋白降解。許多情況下并不需要加入蛋白胸抑制劑，建議首先在不加抑制劑的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。絲氨酸蛋白胸抑制劑的使用尤其要小心。若純化的蛋白須經(jīng)凝血齣（貨號(hào)69671-3）,Xa因子（69036-3）或重組腸激酶（貨號(hào)69066-3）酶切以除去融合標(biāo)簽，溶液中存留的少量絲氨酸蛋白齣抑制劑都可能影響切割反應(yīng)的效率。若發(fā)現(xiàn)存在目的蛋白的水解，需要加入蛋白卿抑制劑時(shí)，請(qǐng)嘗試加入：AEBSF（10-IOOpM；Calbiochem貨號(hào)101500）:PepstatinA（1pM：Calbiochem貨號(hào)516482）:Leupeptin（10-10

47、0pM；Calbiochem貨號(hào)108975）:Aprotinin（2pg/ml：Calbiochem貨號(hào)616398）:Benzamindine（15pg/ml；Calbiochem貨號(hào)324890）:或蛋白酶抑制劑混合物系列III（無EDTA：Calbiochem貨號(hào)539134）.MERCKII進(jìn)行一步透析或凝膠過濾以徹底排除抑制劑的可能影響。蛋白可溶性及細(xì)胞定位由于His-Tag融介蛋白與N產(chǎn)的結(jié)合不依賴于HisTag標(biāo)簽的三級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白可以在天然或變性條件下純化。若需確立最佳純化策略，應(yīng)首先進(jìn)行日的蛋白的細(xì)胞定位，判斷所表達(dá)蛋白是可溶形式還是包涵體，是定位于細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞周質(zhì)。攜帶有

48、信號(hào)肽序列的外源蛋白可能分泌進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)，但這依賴于宿主菌、信號(hào)肽序列以及重組蛋白本身的性質(zhì)。注意：在外源蛋白N端構(gòu)建了分泌信號(hào)肽，則HisTag融介標(biāo)簽不能構(gòu)建于N端，因?yàn)樵诳缒みM(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)腔時(shí)，HisTag標(biāo)簽可能與信號(hào)肽一起被切掉。天然或變性條件下目的蛋白的純化選擇在天然或變性條件純化日的蛋白，需要考慮到蛋白的定位、可溶性、HisTag空間上的可接近性、目的蛋白下游應(yīng)用，以及是否需要保持蛋白生物活性等因素。另外，若蛋白在后續(xù)應(yīng)用時(shí)必須保持活性，則需考慮蛋白是否可以有效復(fù)性，方可采用變性條件純化，并在純化后進(jìn)行蛋白重折疊與復(fù)性。天然條件下目的蛋白純化HisTag融合帝門必須以口溶形式表認(rèn)，

49、方可右：尺然條件卞講行純化勿即仲表達(dá)的人湘分丨I的帝門部以何涵體形式存右：，跡常還/右右：部分可溶帝門，可以右:尺獄條件卞純化MIL夭然條件卞，可以將HisTag融合宙門打苴結(jié)合帝門（如表達(dá)細(xì)加山衣右：的師的亞率和1:結(jié)合帝門）共純化.結(jié)合蛋白可在純化之前加入裂解液中，也可在His-Tag融合蛋白與親和基質(zhì)結(jié)合之后再加入。天然條件下雜蛋白的非特異性結(jié)合通常比變性條件下的非特異性結(jié)合程度高。天然條件純化時(shí)，第一次漂洗有更多的雜蛋白被洗下，正反映了這一點(diǎn)?？梢酝ㄟ^在裂解/結(jié)合緩沖液和漂洗緩沖液中加入低濃度的咪哇（10-20mM）來降低非特異性結(jié)合（例如選用1xNi-NTA漂洗緩沖液,貨號(hào)70925

50、,含有20mM咪哇）在極少數(shù)情況下，HisTag融合標(biāo)答傣被丨的術(shù)門的紐結(jié)構(gòu)険誡從而陽礎(chǔ)了HisTaq丿汕IU0ft的結(jié)合,這種怙況卞可溶帝門也需遽變件方他講行金屈離了螫合從析。列議右:帝門純化i寸稱中.設(shè)&/、懇件條件卞純化U的爼白的對(duì)照。若蛋白只能在變性條件下方能與樹脂結(jié)合，但目的蛋白又不適合變性純化，通?？梢酝ㄟ^將His-Tag標(biāo)簽構(gòu)建至目的蛋白另一末端來解決這一問題。由于各種不同目的蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白與樹脂的結(jié)合有不同的影響，很難給出一個(gè)His-Tag融合蛋白在天然條件下純化的通用流程，然而也有一些優(yōu)化純化流程的一般建議：可用BugBuster!白抽提試劑溫和裂解細(xì)菌，也可加入Benzo

51、nase核酸齣降解核酸，降低裂解物粘度。另外，也可通過溶菌酶處理后超聲或高壓勻漿的方法裂解菌體。為防止蛋白降解，菌體和裂解物應(yīng)始終保持0-4C低溫，可能需要加入蛋白酶抑制劑。裂解/結(jié)介緩沖液及漂洗緩沖液中加入低濃度咪卩坐有助于減少雜蛋白的非特異性結(jié)合。緩沖液保持一定離子強(qiáng)度有助于減少雜蛋白與目的蛋白之間的非特異性結(jié)合，以及雜蛋白與樹脂基質(zhì)間的非特異性結(jié)合。結(jié)合和漂洗時(shí)緩沖液中最低鹽濃度為300mMNaCL最高可達(dá)2MNaCI（請(qǐng)參考表2）。含前導(dǎo)信號(hào)肽序列的蛋白，可通過滲透休克，從細(xì)胞周質(zhì)組分中純化出分泌蛋白，計(jì)算蛋白分泌表達(dá)的效率（請(qǐng)參考pET系統(tǒng)手冊(cè)s細(xì)胞周質(zhì)蛋白樣品制備”部分）。變性條件

52、下目的蛋白的純化在多種表達(dá)體系中，重組蛋白的髙水平表達(dá)常導(dǎo)致形成不溶聚合物，在大腸桿菌中被稱為包涵體。強(qiáng)變性條件如6M鹽酸丿呱、8M尿素可徹底溶解細(xì)胞.包涵體和His-Tag融合蛋白。其他變性劑和去污劑也可能有效，但是選擇那種變性劑以及所使用的濃度都需根據(jù)具體情況進(jìn)行摸索確定。變性條件下，融合蛋白的His-Tag序列充分暴露，與N產(chǎn)的結(jié)合充分，而且由于雜蛋白的非特異性結(jié)合減少，能獲得更高的純化效率。變性條件下純化的目的蛋白是否需要復(fù)性，視目的蛋白不同應(yīng)用而定。蛋白的復(fù)性和重折疊可以在從樹脂上洗脫之前進(jìn)行，也可在洗脫后的溶液中進(jìn)行（請(qǐng)參考蛋白重折疊試劑盒70123操作說明書）。1.MERCK小批

53、純化或柱層析純化方法11蛋白可以采用柱層析或批雖操作的方式進(jìn)行純化。批量純化的方法使蛋白溶液與樹脂懸液可以在小管中充分混合結(jié)合，再將蛋白樹脂混合物加入柱中進(jìn)行漂洗.洗脫步驟，或直接在小管中漂洗洗脫目的蛋白。這種方法能促進(jìn)HisTag融合蛋白與樹脂的充分結(jié)合，在HisTag序列未充分暴鉤以及裂解液中蛋白濃度過低的情況下，尤其適合采用批量純化方法。在柱層析方法中，首先裝柱，平衡樹脂后再上樣。將細(xì)菌裂解液緩慢加入到色譜柱中，漂洗雜蛋白，再洗脫目的蛋白，后續(xù)步驟與批量純化方法相似。目的蛋白的結(jié)合含有一個(gè)或多個(gè)His-Tag標(biāo)簽的融合蛋白，無論His-Tag位于蛋白的氨基端還是竣某端，通常能與NiNTA

54、或NiIDA基團(tuán)結(jié)合，其親和力遠(yuǎn)高于抗體抗原、或酶底物的結(jié)合力。N產(chǎn)與His-Tag的結(jié)合不依賴于蛋白的空間結(jié)構(gòu)。即使在少數(shù)情況下，HisTag無法與Ni離子完全結(jié)合，但只要有兩個(gè)以上組氨酸殘基就會(huì)與Ni離子有一定的結(jié)合能力：一般來說，可與N戶結(jié)合的His殘基的數(shù)目越少，結(jié)合能力越弱。某些無HisTag標(biāo)簽的宿主菌蛋白，由于其序列具有連續(xù)組氨酸，或兒個(gè)組氨酸殘基在蛋白表而，也可能與N產(chǎn)結(jié)合。但在多數(shù)情況下，這種相互作用要比His-Tag標(biāo)簽與N的相互作用弱得多。這些可能適成干擾的雜蛋白可以通過相對(duì)嚴(yán)苛的漂洗條件（不影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合）除去。目的蛋白可以經(jīng)柱層析或批雖純化。若His-Tag

55、融合蛋白在上樣液中濃度低，或蛋白表達(dá)水平低，或分泌至培養(yǎng)基中，蛋白需用批量純化方式進(jìn)行結(jié)合和純化，其結(jié)合緩沖液的配方應(yīng)盡量滿足以下條件：在不影響目的蛋白與樹脂結(jié)合的基礎(chǔ)上，干擾雜蛋白的結(jié)合。如緩沖液調(diào)至較低的pH值，加入低濃度咪I坐（10-20mM）等。如果純化結(jié)果還是有較多雜蛋白存在，建議在目的蛋白上樣之前，用含咪哇的結(jié)合緩沖液（濃度20mM）平衡樹脂。樹脂的結(jié)合基團(tuán)得到“保護(hù)”，從而顯著降低非特異性結(jié)合。雜蛋白含有相鄰連續(xù)的組氨酸殘基的蛋白在大腸桿菌中不多，但在貞核細(xì)胞中很多。這些蛋白與N的結(jié)合力遠(yuǎn)低于His-Tag序列與N產(chǎn)的結(jié)合力，即使雜蛋白的含量遠(yuǎn)比日的蛋白含量高，也可以較容易地漂洗

56、除去。在結(jié)合緩沖液和漂洗緩沖液中加入低濃度的咪咯可以有效防止雜蛋白與樹脂的結(jié)合。這一點(diǎn)在天然條件下純化目的蛋白時(shí)，尤其重要。在裂解緩沖液中加入20mMp-ME（即B藐慕乙醇），可以減少目的蛋白與雜蛋白之間形成二硫鍵的兒率，避免雜蛋白與目的蛋白共純化（Ni-NTAHis-Bind樹脂與20mMB僦基乙醇兼容，但Ni-IDAHis-Bind樹脂與其不兼容）,而且不可使用DTT（請(qǐng)參考表2）某些蛋白或核酸可以與目的蛋白非特異性結(jié)合，從而共純化下來。這些雜質(zhì)都可以通過采用一宦的漂洗條件進(jìn)行洗脫而除去。如加入低濃度去污劑（0.11%TritonX-100或0.5%Sarkosyl）,增加鹽濃度（可至2M

57、NaCD,或加入乙醇或II汕（可至30%）以減少蛋白間的疏水相互作用。對(duì)于不同目的蛋白，需要具體摸索確怎最佳漂洗條件。核酸也可以通過在最初的裂解步驟中加入Benzonase核酸酶處理而除去。極少數(shù)情況下，某些宿主菌來源的蛋白能與Ni-NTAHis-Bind或Ni-NTAHis-BindSuperflow樹脂基質(zhì)本身相結(jié)合，這種情況可以改用其他基質(zhì)的樹脂，如HisBindQuick或His-BindFractogel樹脂進(jìn)行純化。截短表達(dá)的His-Tag融合蛋白，是經(jīng)常出現(xiàn)的雜蛋白。如表達(dá)時(shí)目的蛋白從序列內(nèi)部起始翻譯（對(duì)C端融合His-Tag的蛋白而言），或翻譯的提前終止（對(duì)N端融合His-Ta

58、g的蛋白而言），或在蛋白表達(dá)和純化過程中部分降解的產(chǎn)物，可以通過其他方法檢測(cè)His-Tag融合蛋白的大小，確定是否存在這樣的問題（如對(duì)于某些的pET載體表達(dá)的蛋白，視其融介表達(dá)的標(biāo)簽情況，可選用HisTagWesternBlot試劑盒或HSV-Tag單克隆抗體等）O對(duì)于帶有His-Tag標(biāo)簽的截短表達(dá)蛋白造成的污染.可能需要將HisTag標(biāo)簽換至目的蛋白另一末端。對(duì)蛋白降解情況，可能需要在細(xì)菌裂解步驟時(shí)加入蛋白齣抑制劑，以盡量抑制日的蛋白的降解。建議在純化時(shí)選擇合適的樹脂雖，使其載量接近需純化的HisTag融合蛋白的量。由于HisTag融合蛋白與Ni2+的親和力高于其他背景雜蛋白，若HisTa

59、g融合蛋白上樣量接近使用的樹脂載量，樹脂上剩余的能與雜蛋白結(jié)合的位點(diǎn)很少，從而能獲得更好的純化效果。如何降低非特異性結(jié)合使用His-Bind方法純化目的蛋白時(shí)，天然條件與變性條件相比，可能有更多雜蛋白與樹脂非特異性結(jié)合。裂解/結(jié)合緩沖液和漂洗緩沖液中加入低濃度的咪（10-20mM）,有助于減少非特異性結(jié)合。HisTag標(biāo)簽通過610個(gè)組氨酸殘棊上的咪哇環(huán)與Ni離子作用。咪哇本身也可與NP結(jié)合.破壞分散的組氨酸的咪哇環(huán)與N產(chǎn)的作用。610個(gè)連續(xù)組氨酸標(biāo)簽與N的結(jié)合力很強(qiáng)，所以低濃度的咪I吐的存在能降低雜蛋白的非特異性結(jié)合。對(duì)于多數(shù)蛋白來說，在裂解/結(jié)合緩沖液和漂洗緩沖液加入高達(dá)20mM的咪I坐都不會(huì)影響目的蛋白產(chǎn)量，若日的蛋白在此條件下無法結(jié)合到樹脂上，咪I坐的濃度可以調(diào)至1-5mMoHis-Tag融合蛋白與Ni?+金屬螫與基質(zhì)的結(jié)介與His-Tag標(biāo)簽的空間構(gòu)象無關(guān)，也不受大