分子生物學(xué)技術(shù)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第四講一、DNA序列測(cè)定-研究DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA序列測(cè)定的方法： 1、雙脫氧末端終止法(Sanger法) 2、化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert法） 3、全自動(dòng)DNA測(cè)序這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)概述： Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作為鏈終止劑。2,3-ddNTP脫氧核糖的3位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。

2、在每組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入1種ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（高壓電泳），就可讀出序列。（一）、雙脫氧末端終止法測(cè)序原理（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)HOHH 、CH2P-P-P-O（1）、可將待測(cè)模板制作成僅差1個(gè)堿基的寡核苷酸片段；（2）、高分辨率的PAGE可使僅差1個(gè)堿基的寡核苷酸片段有不同的泳動(dòng)速度而分開。模板合成的序列： 5， TTACGTCATDNA鏈末端合成終止法GATC 測(cè)序反應(yīng) 電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAAC

3、GTGAACGTAACGAACAAA5 3 負(fù)極正極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理模板：5 AGTCCACGTT53、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。 *DNA自動(dòng)測(cè)序儀上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測(cè)定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀結(jié)果的讀片過程。1987年發(fā)明

4、了一種準(zhǔn)確快速的DNA測(cè)序方法，即激光測(cè)序法和配套的自動(dòng)測(cè)序儀。ddGddAddTddC紅色熒光綠色熒光黃色熒光藍(lán)色熒光電泳DNA序列自動(dòng)分析原理及結(jié)果圖* 自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序法原理自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序是在雙脫氧末端終止法測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。其基本原理是，在4個(gè)雙脫氧核糖核苷三磷酸分子上各自共價(jià)連接一個(gè)能發(fā)出特定熒光的熒光染料分子，這樣，當(dāng)某一個(gè)特定的ddNTP-熒光染料分子摻入到正在延伸的DNA單鏈分子中就終止了此DNA單鏈分子的延伸并標(biāo)記上了特定的熒光染料分子。所以，自動(dòng)測(cè)序儀的測(cè)序反應(yīng)可在一個(gè)反應(yīng)體系中一步完成。然后將這些標(biāo)記了特定熒光染料分子的，只差一個(gè)堿基的不同長(zhǎng)度的寡聚核苷酸單鏈片段

5、上樣于同一個(gè)變性聚丙烯酰胺凝膠電脈的加樣孔中，進(jìn)行電泳分離。最后用熒光檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)自動(dòng)讀出DNA序列。由于自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序具有快速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又避免了使用放射性同位素，目前已被廣泛地應(yīng)用于以DNA序列測(cè)定為目的的實(shí)驗(yàn)。 返回目錄返回主頁1、揭示基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)與醫(yī)學(xué)研究相關(guān)性。2、通過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、通過DNA序列測(cè)定對(duì)定點(diǎn)突變（人工操作）進(jìn)行確認(rèn)。 （二）、DNA序列測(cè)定的意義以綠鏈為模板合成紅色鏈以紅色為模板合成綠鏈引物內(nèi)含突變堿基基因定點(diǎn)突變：AT，（1）、與遺傳病相關(guān)，如鐮刀形貧血；高

6、膽固醇血癥。（2）、與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，如Ras（Rat Sarcoma)點(diǎn)突變（Ras蛋白點(diǎn)突變， 12位 甘氨酸頡氨酸；丟失GTP水解酶的活性，Ras基因點(diǎn)突變（在膀胱癌中分離得到了該因），減弱或喪失其水解GTP的功能,使生長(zhǎng)因子-MAPK-酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑信號(hào)加強(qiáng)，細(xì)胞分裂；又如點(diǎn)突變，提前出現(xiàn)終止密碼，生成截短的生長(zhǎng)因子受體致癌；P53基因點(diǎn)突變轉(zhuǎn)為癌基因例：一級(jí)結(jié)構(gòu)改變與與醫(yī)學(xué)研究相關(guān)相關(guān)，如遺傳病，腫瘤，高膽固醇血癥，精神分裂癥，老年癡呆等相關(guān)鐮刀型貧血圖片 1059AB酶切位點(diǎn)A.正常人珠蛋白基因B.鐮刀型貧血病人珠蛋白基因HpaI 7.6Kb 6.4Kb1.分子量Mar

7、ker2.正常人珠蛋白基因酶切圖譜3.鐮刀貧血病人珠蛋白基因酶切圖譜123電泳方向電泳圖譜示意圖二、PCR技術(shù)80年代由美國(guó)年輕的科學(xué)家KB.mullis 建立了PCR技術(shù) PCR Polimorase chain reaction 用于DNA，RNA的定量分析1、PCR的基本概念2、PCR反應(yīng)體系：耐熱的Taq DNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。3、PCR反應(yīng)的基本過程：變性、退火、延伸4、基本原理返回目錄返回主頁返回目錄返回主頁35待擴(kuò)增片段A a引物互補(bǔ)B鏈B b引物互補(bǔ)A鏈b引物a引物第一周期：變性、退火、引物延伸第二周期：變性、退火、引物延伸

8、。因?yàn)閎互補(bǔ)A鏈，a互補(bǔ)B鏈，所以b相當(dāng)于B鏈，a相當(dāng)于A鏈，所以a是b鏈引物，b是a鏈引物。bAaB第三周期：變性、退火、引物延伸bbaababa4、PCR 原理THE PERFECT RESULT PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過25至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，同時(shí)PCR過程中，還會(huì)出現(xiàn)“試管效應(yīng)”，因?qū)Σ煌瑯颖玖康谋容^無法直接用PCR技術(shù)來鑒定。 近年來，隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析（或mRNA的表達(dá)量分析）。幾種常用PCR技術(shù)1）、差異顯示PCR2）、內(nèi)參照相對(duì)定量PCR3）、實(shí)

9、時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析均可用作對(duì)基因拷貝數(shù)的分析，即對(duì)DNA，RNA進(jìn)行定量分析 基本原理：利用所設(shè)計(jì)短的隨機(jī)引物可將模板DNA或cDNA序列擴(kuò)增成長(zhǎng)短不同的DNA片段，如果用相同引物擴(kuò)增來源于兩個(gè)不同組織的DNA，電泳圖譜上可出現(xiàn)有差異的條帶，提示其基因或DNA序列存在拷貝數(shù)的差異。（常用逆轉(zhuǎn)錄PCR差異顯示）A組織 B組織1）、差異顯示PCR或轉(zhuǎn)錄速度快，模板積累多？（一）、差異顯示技術(shù)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴乙錠）染色凝膠拷貝多？2）、內(nèi)參照相對(duì)定量PCR利用管家基因作為PCR體系中的內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，是一種相對(duì)定量的PCR擴(kuò)增基因片段的方法，可通過計(jì)

10、算PCR產(chǎn)物的多少來估計(jì)基因拷貝數(shù)，從而判定該基因拷貝數(shù)在不同個(gè)體之間的差異。PCR產(chǎn)物多可提示該基因拷貝多。常用的內(nèi)參基因是看家基因，如actin基因，三磷酸甘油醛脫氫酶基因。（在電泳圖上有被擴(kuò)增的actin 和G3PDH的條帶。）通常也是采用RT-PCR根據(jù)PCR產(chǎn)物多少來估計(jì)同一基因拷貝數(shù)的差異?？截悢?shù)多？3）、實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析A、Real-time PCR 基本概念與原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、可消除產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾、

11、可根據(jù)動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)精確計(jì)算出樣品中最初模板量的差異，且動(dòng)化程度高，目前已得到廣泛應(yīng)用。 概念：所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入含熒光基團(tuán)的探針引物，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。原理實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3355上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355B、實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析的原理：、Ct值的定義：（CyCle Threslold- Ct值）每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性-見橫軸：熒光信

12、號(hào)量PCR反映循環(huán)數(shù)、Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品并可分別測(cè)得Ct值，依次作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始模板拷貝數(shù)。圖示： 模板含量高， PCR循環(huán)圈數(shù)小，模板拷貝多， Ct值小含不同拷貝樣品達(dá)到規(guī)定的熒光強(qiáng)度域時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)圈數(shù)，即Ct值。每條曲線代表一種具已知拷貝數(shù)的樣品。 橫坐標(biāo)：代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)：Ct值Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值

13、時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。、實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物（電泳圖譜）進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。（熒光積累與擴(kuò)增產(chǎn)物及模板拷貝數(shù)成比例關(guān)系）含不同拷貝樣品達(dá)到規(guī)定的熒光強(qiáng)度域時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，即Ct值。每條曲線代表一種具已知拷貝數(shù)的樣品。含不同拷貝樣品達(dá)到規(guī)定的熒光強(qiáng)度域時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，即Ct值。每條曲線代表一種具已知拷貝數(shù)的樣品。Ct 值所含拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，從上圖可見，含拷貝數(shù)越多的樣品，Ct值越小。Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，圖示

14、，含拷貝數(shù)越多的樣品，Ct值越小。實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，從圖可見，含拷貝數(shù)越多的樣品，Ct值越小。Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，從右圖可見，含拷貝數(shù)越多的樣品（DNA模板濃度），Ct值越小。（左圖橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)） 右圖：縱坐標(biāo)為已知樣品濃度的對(duì)數(shù)D、熒光化學(xué)分子熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為三種：熒光探針和熒光染料及molecular Beacons 探針、現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：1）TaqMan熒光探針：即每擴(kuò)增一條DNA鏈，相當(dāng)于有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2）SYBR Green 染料:3)Molec

15、ular BeaconsMolecular beacons 熒光探針1、利用新型、靈敏、高通量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以用于測(cè)定原始品系中轉(zhuǎn)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)。2、其定量的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料（如：SYBR GREEN 或Taqman 探針），實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光量的變化。3、獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)（閾值）時(shí)所需的PCR循環(huán)次數(shù)即Ct值（Cycle Threshold）；通過將已知模板濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與其濃度的對(duì)數(shù)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上準(zhǔn)確確定待測(cè)樣品的基因拷貝數(shù)。4、熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段D

16、NA 。其結(jié)果是 模板多，即拷貝多，擴(kuò)增產(chǎn)物多，（熒光強(qiáng)度高），Ct值小?？偨Y(jié)：實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。實(shí)時(shí)PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。三、轉(zhuǎn)基因、動(dòng)物克隆與基因敲除技術(shù) 人類基因組計(jì)劃在2003 年完成了全序列草圖的繪制，并隨后包括了小鼠、大鼠、牛、豬、狗、羊、貓等的基因序列也已完成等。這些序列信息都儲(chǔ)存在GenBank中，可以提供給全世界的科學(xué)家免費(fèi)下載使用。 目前,雖然人類基因組全部序列已知,但許多基因功能仍然一無所知，仍有大量的人類新基因和蛋白質(zhì)有待于我們?nèi)グl(fā)掘-后基因組時(shí)代的到來，即功能基因組學(xué), -對(duì)未知基因功

17、能的研究已成為在21世紀(jì)整個(gè)生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。 在基因序列資料已知的基礎(chǔ)上,相關(guān)于功能基因組學(xué)領(lǐng)域的研究已是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和健康產(chǎn)業(yè)的核心,蘊(yùn)藏著巨大的產(chǎn)業(yè)化潛能和經(jīng)濟(jì)效益,并與人類的健康息息相關(guān)。前言： 基因功能是在由細(xì)胞組成的器官組織中，在多層次的復(fù)雜生命體中實(shí)現(xiàn)的，因此對(duì)基因功能的研究只有在活體中才能接近真實(shí)的再現(xiàn)一個(gè)特定基因的表達(dá)和導(dǎo)致的后果；這是目前層次最高的實(shí)驗(yàn)體系，最好利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或細(xì)胞模型。 基因功能分析的方法：基因敲除技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型、RNA干涉技術(shù)等。人類功能基因的主要開發(fā)價(jià)值例如: 1、基因工程藥物; 2、 藥物靶標(biāo); 3、 免疫靶標(biāo); 4、 基

18、因治療靶基因; 5、 疾病診斷和易感分析標(biāo)志; 6、 生物技術(shù)支撐產(chǎn)品等,特別是在藥物開發(fā)領(lǐng)域具有重大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞，胚胎干細(xì)胞中（或其它受體細(xì)胞），通過外源基因與受體細(xì)胞染色體DNA之間隨機(jī)重組的發(fā)生而將外源基因插入到受體細(xì)胞染色體DNA分子上的過程。2、 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（植物）或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。并被轉(zhuǎn)入外源基因的動(dòng)物或細(xì)胞能將將外源基因遺傳給后代。 I、轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)概念： 3、利用動(dòng)物（植物，細(xì)胞)模型研究未知基因的功能，就是將外源基因引入動(dòng)物基因組（或讓基因組中的某一基因過表達(dá)），產(chǎn)生在遺傳上經(jīng)過基因工程修飾（改造）的動(dòng)物，

19、實(shí)現(xiàn)在整體動(dòng)物、細(xì)胞或分子水平上認(rèn)識(shí)基因的功能或人類疾病發(fā)生的分子機(jī)制。（一）、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因的動(dòng)物。2、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的操作過程：1）、轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建；2）、將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；3）、將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮4）、對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行鑒定。1982年，首次成功獲得轉(zhuǎn)基因小鼠受精卵或著床前的胚胎干細(xì)胞3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)例：轉(zhuǎn)基因小鼠：獲得來自大鼠的生長(zhǎng)激素基因 我國(guó)首例轉(zhuǎn)基因牛“滔滔”1999，3，上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所，曾溢滔，黃淑幀教授；攜帶人血清白蛋白。2001年，乳汁可分泌人乳球蛋白環(huán)球時(shí)報(bào)(2001年03

20、月06日第七版)863計(jì)劃 Example. Phenotypic analysisPhenotypic Analysis on founders harboring GFP gene(9.5 dpc) GFP+, GFP- embryos GFP+ tail GFP-, GFP+ mice野生型小鼠轉(zhuǎn)基因型小鼠 野生型小鼠 轉(zhuǎn)基因小鼠哈醫(yī)大生化教研室高旭教授制作的ALASE過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠在紫外燈下呈現(xiàn)紅色（野生型小鼠無此現(xiàn)象）轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)基因報(bào)告基因增強(qiáng)子啟動(dòng)子受精全能性細(xì)胞注射 植入假孕小鼠后代Southern blotRT-PCRWestern blot轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)報(bào)道：Rubin

21、 人 ApoA-I轉(zhuǎn)基因小鼠，研究動(dòng)脈硬化；Marban 培養(yǎng)出具高胰島素的小鼠模型等；北大醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系制作了EB病毒BLLF1基因轉(zhuǎn)基因小鼠，具淋巴瘤的發(fā)病特征、組織病理學(xué)的特點(diǎn)及遺傳穩(wěn)定性， 證明該小鼠模型可能成為探討淋巴瘤發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。1）、基因表達(dá)調(diào)控研究，包括基因表達(dá)時(shí)空特異性研究；2）、基因新功能的研究；3）、用于在胚胎期才表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究；4）、遺傳性疾病的研究；5）、建立人類疾病的動(dòng)物模型（如Alzeimers病，糖尿病等模型），為人類的基因治療提供依據(jù)；6）、動(dòng)物新品種的培育；7）、基因工程產(chǎn)品（藥品）的制備；4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用：1）、有時(shí)不能將外源基因定向地

22、插入受精卵細(xì)胞染色體的特定部位；2）、外源基因隨機(jī)整合可能引起插入突變，破壞宿主基因組功能；3）、外源基因隨機(jī)整合在宿主染色體上的拷貝數(shù)不同，可能出現(xiàn)不同表現(xiàn)型；4）、整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物癥狀的不穩(wěn)定遺傳。 5、轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題1、 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型：是一種最常用的細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)基因模型，外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程被插入到細(xì)胞染色體中，使外源基因可以作為細(xì)胞染色體的一部分得以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)并遺傳。（二）、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞模型例如：1）、-synuclein （突觸核蛋白)-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型用于研究帕金森氏病2）、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP瑞士突變基因cDNA的小鼠細(xì)胞-研究阿爾茨海默病3）

23、、GSK313（糖原合成酶激酶3）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型- 研究糖代謝障礙2、制作細(xì)胞模型（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞）的基本過程：1）、真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將外源基因和真核表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒；2）、在原核細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增和克隆化真核重組表達(dá)質(zhì)粒；3）、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞；4）、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆化篩選、保存；5）、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白、提取、鑒定。1、 相關(guān)概念 該技術(shù)是將動(dòng)物的一個(gè)體細(xì)胞胞核導(dǎo)入另一個(gè)體的去除了胞核的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，然后置于代孕母體，使之發(fā)育成后代。這樣的后代個(gè)體所攜帶的遺傳性狀僅來自一個(gè)父親或母親個(gè)體，因而也稱無性繁殖，是一個(gè)個(gè)體的完全拷貝，故稱克?。╟lone)。有

24、利于搶救頻臨滅絕的動(dòng)物、核轉(zhuǎn)移技術(shù)（動(dòng)物克隆技術(shù)）“多利”的誕生 1997年2月27日英國(guó)愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動(dòng)了全世界。世界上第個(gè)克隆羊多利2、克隆動(dòng)物中國(guó)完成世界首例轉(zhuǎn)基因克隆兔實(shí)驗(yàn)(圖) 左為克隆兔，右為代孕兔。2007年12月14日 09:20:43 來源：科技日?qǐng)?bào) 中國(guó)首例異種克隆動(dòng)物“北山羊”在新疆降生2004美國(guó)科學(xué)家成功克隆靈長(zhǎng)類動(dòng)物韓國(guó)培養(yǎng)出世界上首批克隆狗、 基因敲除技術(shù) （一）、基因敲除的基本概念 (gene knock out) 1、基因敲除技術(shù)：是通過一定

25、的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。2、基因敲除動(dòng)物：通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因的動(dòng)物稱為基因敲除動(dòng)物。目前基因敲除小鼠是應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型之一。（二）、基因敲除的原理與程序關(guān)于同源重組：homologous recombinationHolliday intermadiate 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Ho

26、liday中間體53535353目 錄Holiday中間體535353535355533355553333555533335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體目 錄片段重組體（二）、基因敲除的原理與程序1、制備基因敲除的胚胎干細(xì)胞 1）、打靶載體的構(gòu)建：在一克隆載體上組裝包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于篩選的 新霉素（Neor）基因和胸苷酸激酶基因(tk) 。2）、將構(gòu)建的打靶載體轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞，(為使靶載體上的新霉素基因能與干細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)基因發(fā)生同源重組而剔除目標(biāo)基因)。3）、篩選基因敲除的胚胎干細(xì)胞這樣打靶載體包含

27、了：1)、部分待剔除的基因片段，（用于與野生型的該基因進(jìn)行交換重組）2)、陽性篩選標(biāo)志基因（Neor ，neomycin-resistance gene) 、使細(xì)胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表達(dá)產(chǎn)物分解）的能力。3)、陰性篩選標(biāo)志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，來自單純庖疹病毒（HSV），當(dāng)它在受體細(xì)胞內(nèi)合成出tk時(shí)，可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入更昔洛韋，即gangcyclovir（一種環(huán)鳥苷酸底物)而產(chǎn)生有毒的分解物使細(xì)胞死亡，為陰性篩選標(biāo)志。 待剔除基因克隆克隆載體重組載體切割基因使待剔除基因失去活性陽性標(biāo)記基因Neor連接HSV-tk打靶載體 在特

28、定基因剔除時(shí)，利用打靶載體上留下的部分待剔除的基因片段作為基因組上相同基因的同源臂，當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組的同源基因發(fā)生同源重組時(shí)（聯(lián)會(huì)），打靶載體上的失活基因替代基因組上的基因，同時(shí)利用插入在基因同源臂之間的陽性、陰性標(biāo)志基因進(jìn)行篩選鑒定。2、制備基因敲除動(dòng)物（小鼠）4)、將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入來自黑色的小鼠胚泡中（形成嵌合體胚胎，兩套基因物質(zhì)）5)、將胚泡植入假孕小鼠子宮中發(fā)育。6)、誕生出雜合的嵌合體小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干細(xì)胞來自褐色小鼠，正常胚胎來自黑色小鼠。7)、嵌合體小鼠與野生黑色小鼠交配，產(chǎn)生純黑色與純褐色的后代小鼠，其純褐色小鼠為雜合子，有一目的基因已被敲除。8)

29、、近親交配，產(chǎn)生純合子基因敲除小鼠（第四代）。褐色小鼠待剔除基因克隆克隆載體重組載體切割基因使待剔除基因失去活性陽性標(biāo)記基因Neor連接HSV-tk打靶載體1231)、號(hào)發(fā)生位點(diǎn)同源重組，在G418培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；2）、號(hào)為隨機(jī)插入重組，帶入tk基因，可在G418培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但在gangcyclovir培養(yǎng)基中被殺死；3）、號(hào)未發(fā)生任何重組，為正常細(xì)胞，在G418培養(yǎng)基中被殺死。抵抗G418的基因tk基因黑色小鼠褐色小鼠1）、Neor （neomycin-resistance gene)基因：陽性篩選標(biāo)志，使細(xì)胞具有抵抗新霉素（G418）能力。2）、胸苷酸激酶(thymidine kinase

30、)的作用：陰性篩選標(biāo)志，分解底物為gangcyclovir 殺死細(xì)胞（自殺基因）小鼠基因敲除發(fā)表了2005年8月12日的Cell封面文章。這里有一篇當(dāng)時(shí)的中文報(bào)道。 三、利用基因沉默技術(shù)對(duì)基因功能進(jìn)行分析 結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過其表達(dá)的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)基因功能的研究可以在RNA水平上進(jìn)行，通過降解mRNA，干預(yù)蛋白質(zhì)的翻譯，或減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類：一類是反義RNA技術(shù)封閉mRNA的功能；另一類是RNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。（一）、反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將

31、其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶識(shí)別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動(dòng)子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA（antisense RNA)能與mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA分子稱之，（與編碼鏈的堿基排列順序方向一致。而與模板鏈同源）有意義，正，編碼鏈；反意義，負(fù)，模板鏈 反義RNA調(diào)控 1984年Adelman等發(fā)現(xiàn)大鼠的促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone,G

32、nRH）的基因兩條鏈都能轉(zhuǎn)錄，首次在真核中發(fā)現(xiàn)了反義RNA。 在線蟲（C.elegans）中，控制幼蟲發(fā)育的基因lin 14基因受到lin 4基因的反義調(diào)節(jié)。這是一種對(duì)翻譯模板的抑制來進(jìn)行調(diào)控的途經(jīng)。 1、反義RNA 對(duì)胃癌細(xì)胞MT1,MMP 基因表達(dá)的抑制2、反義RNA對(duì)丙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制3、反義RNA 對(duì)肝癌C-myc表達(dá)的抑制4、BCL-2 基因的反義RNA 用于治療B淋巴瘤和白血病相關(guān)報(bào)道：（二）、RNA干涉技術(shù)RNA干涉技術(shù) 是指由短的雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源RNA降解的過程，可使基因的表達(dá)受到抑制。它是在基因的轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的一種研究基因功能的方法。 最早是由Andre

33、w Fire 和Craig Mellocai 兩人在1998年2月一次實(shí)驗(yàn)中，將雙鏈RNA注射給線蟲，發(fā)現(xiàn)其可以引起一種高效、特異的基因抑制效應(yīng)，他們將這種由雙鏈RNA引起的特異性基因抑制現(xiàn)象稱為RNA干涉。 3)、條件性基因敲除（conditional gene knock out）A、概念：基因敲除可在動(dòng)物（小鼠）的特定時(shí)期或特定組織中剔除特定基因，或稱條件性組織特異性基因敲除（conditional tissue specific gene knock out）B、基本原理：1）、制作基因敲出小鼠（同源重組），使該小鼠基因組中的一個(gè)待敲除的基因兩側(cè)引入Loxp序列，如圖待敲除的基因序列Loxp序列，由重組酶Cre識(shí)別，并可將綠色目標(biāo)基因切除。前述操作與常規(guī)基因敲除程序相同，如制作打靶載體，含NEO抵抗基因，tk 基因，制作基因敲除的胚胎干細(xì)胞.2）、制作轉(zhuǎn)基因小鼠，使其基因組中含Cre重組酶，并使該基因處于一可被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的下游（如四環(huán)素可誘導(dǎo)Cre基因表達(dá).）3）、令1,2兩種基因改變的小鼠交配，篩選在基因組中兩種序列都存在的小鼠后代，如圖（或?qū)re重組酶基因再導(dǎo)入小鼠（1），以小鼠（1）為受體動(dòng)物。5，啟動(dòng)子Cre重組酶基因四環(huán)素誘導(dǎo)，基因表達(dá)mRNA表達(dá)的Cre酶沒誘導(dǎo)存在時(shí)，該基因不表達(dá)，所以可達(dá)到在特定時(shí)期，特定組織的基因敲除。據(jù)悉：北大醫(yī)學(xué)部成功繁育出脂