蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學

1、關(guān)于蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學第一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)組學DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細胞特異性基因表達生理狀態(tài)蛋白質(zhì)相互作用溫度應(yīng)激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數(shù)量有限結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反應(yīng)生命現(xiàn)象復(fù)雜的調(diào)控第二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學的定義 蛋白質(zhì)組 protein + genome proteome 一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì) 一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì)第三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)組學旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組

2、成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)律 一、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學的定義第四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析第五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性 質(zhì)、生物學功能的差異進行： 1、根據(jù)溶解度 2、根據(jù)分子量 透析和超濾 平衡離心 凝膠過濾層析 （三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法一、分 離 純 化第六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

3、3 、根據(jù)電荷毛細管電泳離子交換層析一、分 離 純 化第九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4 、根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力 親和層析第十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（四） 蛋白質(zhì)分離純化的條件緩沖液鹽、金屬離子和螯合劑還原劑去垢劑蛋白酶抑制劑 表面效應(yīng)蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 溫度 儲存 一、 分 離 純 化第十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、分析鑒定（一）Western印跡技術(shù)基本操作步驟： 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標蛋白質(zhì)的顯示western 印跡基本步驟圖示第十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

4、Western免疫印跡用于測定特定蛋白質(zhì)的大小和含量 基本原理將經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體上，以針對特定蛋白質(zhì)的抗體作為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位進行特異性反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用二抗檢測。 常用的二抗是與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白或A蛋白；實際應(yīng)用中常常還需要設(shè)置適當?shù)膶φ?。第十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月常需要內(nèi)參蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN 第十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 將SDS的高分辨能力與抗原抗體反應(yīng)的特 異性、敏感性相結(jié)合 (靈敏度達到ng級)

5、蛋白電泳在變性條件下進行，消除了蛋白溶解、 聚集以及與外來蛋白共沉淀等問題 特點第十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫熒光法(immunofluorescence)主要用于檢測目的蛋白在細胞內(nèi)的定位。 基本原理將待檢的目的蛋白作為抗原，固定在載玻片上，先加上針對目的蛋白的抗體(第一抗體)進行反應(yīng)，再加上針對第一抗體的熒光素標記抗體(第二抗體)進行反應(yīng)，稱作間接免疫熒光法。如果將熒光素標記在第一抗體上，則不用再加第二抗體，稱作直接免疫熒光法。 特點 需要在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果； 無法檢測目的蛋白的大?。?操作簡便，但需設(shè)立必要的對照；第十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

6、免疫熒光法(immunofluorescence)例 1例 2第十七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫沉淀(immunoprecipitation)技術(shù) 將抗體加入蛋白混合溶液，使之與相應(yīng)抗原結(jié)合； 加入固定的抗體結(jié)合蛋白 (如: Protein A-瓊脂糖珠)； 經(jīng)離心后，與Protein A結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物便可沉淀 ； 將樣品變性后即可獲得游離的抗原蛋白 ； 基本步驟 基本原理利用一種可離心沉淀的抗體結(jié)合蛋白(如Protein A, Protein G等)，將抗原-抗體復(fù)合物從蛋白混合溶液中分離，進行定量或定性研究。 為方便后續(xù)分析，在免疫沉淀前，常會對抗原進行標記。第十

7、八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫共沉淀 (co-IP)技術(shù) 基于與蛋白質(zhì)X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，則蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來。Y的這種免疫沉淀被稱為免疫共沉淀(co-immunocipitation, Co-IP)，此法最常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合。YABY裂解細胞 免疫共沉淀蛋白質(zhì)X第十九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）二維凝膠電泳（2-DE)是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異二、分析鑒定第二十張，PPT共

8、四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二維雙向電泳(2D electrophoresis) 基本原理基于等電點與分子量分離蛋白質(zhì)IEF-focused proteinsSDS-charged proteins in IPG stripSDS-charged proteinsresolved according to sizes in SDSgel第二十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2-DE原理示意圖二、分析鑒定第二十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜志利用不同pK固定化電解質(zhì)可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設(shè)計 第一相

9、電泳：IPGIFE平衡 第二相電泳：SDSPAGE考馬斯亮藍染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色二、分析鑒定第二十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜二、分析鑒定第二十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：可以同時直觀顯示數(shù)千個蛋白質(zhì)點；缺點：耗時，耗力，目前無法自動化；難以分離疏水、具極端分子量 或等電點的蛋白質(zhì)（如膜受體蛋白、組蛋白等）。二維雙向電泳(2D electrophoresis)silver staining (3000 spots)第二十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)染色考馬斯亮藍染色銀染：靈敏度高

10、；“雪崩”效應(yīng)；末端封閉銅染第二十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 通過2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。 (三)圖像分析技術(shù)二、分析鑒定第二十七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 2-DE圖像分析軟件包操作過程： 圖像采集斑點檢測背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較二、分析鑒定第二十八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 放射性核素標記親和標簽法正常細胞D0親和標簽病理細胞D8親和標簽混合并消化生物素親和純化液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析測量兩個不同樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度二、分析鑒定第

11、二十九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白芯片(protein chip)技術(shù) 將一系列“誘餌”蛋白以陣列方式固定在經(jīng)過特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些和“誘餌”結(jié)合的蛋白才被保留在芯片上。其實質(zhì)是酶聯(lián)免疫吸附測定。 基于蛋白質(zhì)表面化學及質(zhì)譜檢測的高通量蛋白質(zhì)分析技術(shù)第三十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白芯片(protein chip)技術(shù) 基本方法 蛋白質(zhì)的結(jié)合：未經(jīng)處理的樣品(如血清，尿液等)直接點在芯片 上，根據(jù)芯片表面不同的化學或生物特性結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)； 清洗減少非特異性蛋白(如鹽及其它污染物)的結(jié)合； 加能量吸收分子(EAM)：EAM能

12、有效的吸收激光的能量，使樣品 分子進入氣相并得到電離； 用表面增強的激光解吸電離法(SELDI)將保留在芯片上的蛋白質(zhì) 洗脫下來； 電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜儀精確地測定它們的質(zhì)量；第三十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白芯片(protein chip) 技術(shù)從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲、檢測 和分析蛋白質(zhì)不需任何標記或加尾 超高的檢測靈敏度 (1-50 fmole的蛋白質(zhì)) 從超小樣品體積(0.5 l)到大體積(400l) 快速獲取實驗結(jié)果第三十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白芯片(protein chip) 技術(shù) ProteinChip的應(yīng)用第三

13、十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)芯片第三十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和 電荷比值（質(zhì)荷比，m/e）的差異確定分子量。應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析 研究蛋白質(zhì)的修飾（五）質(zhì)譜技術(shù)二、分析鑒定 第三十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（六） 其它方法Edman降解法測定蛋白質(zhì)多肽的排列順序。核磁共振（NMR）、熒光光譜法測定溶液中蛋白質(zhì) 分子的結(jié)構(gòu)。X射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白 質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等。二、分析鑒定第三十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用第三十七張，PPT共四

14、十九頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Database)第三十八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（三）蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（四）DIP數(shù)據(jù)庫第三十九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫： http:/www.ebi.ac.uk/swissprot PIR和PSD數(shù)據(jù)庫 / /pir 第四十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)倉庫 /pdb/ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫 http:/scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ PROSITE數(shù)據(jù)庫 http:/www.expasy.ch/proside/ （二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫第四十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）蛋白質(zhì)直系同源簇（COGs)數(shù)據(jù)庫 /COG（四）DIP數(shù)據(jù)庫(DIP Database) / 一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫第四十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二