糞便檢驗(yàn)及進(jìn)展

1、糞便查驗(yàn)及進(jìn)展糞便查驗(yàn)及進(jìn)展xxxxxxxxxx糞即是由未消化的食品、經(jīng)消化后未汲取的食品殘?jiān)c消化系統(tǒng)分泌物、 消化道粘膜零落物以及微生物、寄生蟲(chóng)等構(gòu)成的混淆物。進(jìn)行糞查驗(yàn)?zāi)軌颢@取 被檢者消化系統(tǒng)功能、病理變化以及微生物和寄生蟲(chóng)感染等寬泛的信息，詳細(xì) 來(lái)說(shuō)，進(jìn)行糞查驗(yàn)，一能夠認(rèn)識(shí)消化道及通向消化道的肝、膽胰等器官能否有 阻塞、炎癥和出血等狀況；二能夠挑選和診療消化道惡性腫瘤；三能夠大略判 斷胰腺的外分泌功能；四能夠診療消化系統(tǒng)的某些微生物和寄生蟲(chóng)感染。第一節(jié)糞便慣例查驗(yàn)方法回首一、目視檢查在某些疾病狀況下，糞便的顏色、性狀等有特定的明顯改變，這些肉眼可 見(jiàn)的明顯變化擁有必定的診療意義。如在膽

2、道阻塞時(shí)，糞便因缺少膽色素而呈 白陶土樣灰白色；上消化道出血時(shí)，大即可呈柏油樣黑而擁有特別光彩；在霍 亂、副霍亂時(shí)，大便呈米沿水樣；在阿米巴腸炎時(shí)，大便常常帶有果醬樣的膿 血；在腫瘤等以致下消化道出血或痔瘡出血時(shí)，大便常常帶有鮮血。此外，消 化不良時(shí)，糞便含許多未消化的食品殘?jiān)?；蛔蟲(chóng)、絳蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)感染時(shí)，有時(shí) 能從糞便中看見(jiàn)蟲(chóng)體。二、xx檢查借助一般光學(xué)顯微鏡，我們能夠檢出糞便標(biāo)本中的脂肪小滴、血細(xì)胞、真 菌、某些寄生蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵等病理成分有。發(fā)現(xiàn)脂肪小滴增加提示有腸蠕動(dòng) 亢進(jìn)、腹瀉或胰腺外分泌功能減退等可能；發(fā)現(xiàn)大批膿細(xì)胞或白細(xì)胞，提示有 菌痢等感染性腸炎；發(fā)現(xiàn)大批紅細(xì)胞和極少許白細(xì)胞，多

3、提示為下消化道出血 或痔瘡出血；發(fā)現(xiàn)大批真菌能夠確診真菌性腸炎；發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)或蟲(chóng)卵能夠確診 該寄生蟲(chóng)感染。經(jīng)過(guò)電子顯微鏡，我們還能夠檢出糞便標(biāo)本中的某些病毒體。三、糞便的化學(xué)檢查1/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展慣例的糞便化學(xué)查驗(yàn)主要包含糞便隱血實(shí)驗(yàn)和膽紅素及其衍生物查驗(yàn)。隱 血實(shí)驗(yàn)主要用于消化道出血的診療。膽紅素及其衍生物查驗(yàn)可用于嚴(yán)重腹瀉、 消化道菌群大批克制、膽道阻塞以及溶血性疾病的協(xié)助診療實(shí)驗(yàn)。四、大便致病菌查驗(yàn)人類的腸道中有大批種類眾多的微生物，此中絕大多數(shù)是不致病的如：各樣厭氧菌、大腸埃希氏菌和腸球菌等，只有少部分為致病微生物。大便 的細(xì)菌學(xué)查驗(yàn)慣例的目的就是從這些大批的微生物中分別出致病菌。.

4、霍亂弧菌查驗(yàn)?；魜y在我國(guó)急性傳得病管理?xiàng)l例中列為“甲類”，其發(fā)病急，病程進(jìn)展快，所以要求快速、正確報(bào)告。臨床上常常依據(jù)霍亂弧菌在革 蘭氏染色中的形態(tài)及特別的“魚(yú)群樣”擺列，在暗視線下的快速運(yùn)動(dòng)及相應(yīng)抗血清的制動(dòng)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行快速的初步報(bào)告，再進(jìn)行分別培育、判定來(lái)確診。.其余致病菌分別培育。目前已認(rèn)識(shí)到的能從糞便中發(fā)現(xiàn)的病原微生物達(dá)數(shù)十種之多，如沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、酵母菌以及致病性大腸桿菌和綠膿 桿菌等。要從大便標(biāo)本的大批菌群中分別這幾十種致病菌，查驗(yàn)科一般采納選 擇性培育基如SS瓊脂、GN增菌液、麥康凱瓊脂等?？墒悄壳皼](méi)有一種能用 于所有致病菌的選擇培育基（事實(shí)上很難或不行能作到），所以臨床上

5、常常采 納多種選擇性培育基聯(lián)用以提升檢出率。五、其余大便查驗(yàn).大便的病毒查驗(yàn)?zāi)壳把芯孔疃嗟氖禽啝畈《竞图仔透窝撞《镜牟轵?yàn)。有研究報(bào)告指出輪狀 病毒是我國(guó)嬰幼兒秋冬天節(jié)流行性腹瀉的主要致病病原，因?yàn)檫@種腹瀉沒(méi)有特 色性的病變指標(biāo)，從大便中檢出輪狀病毒就是重要的診療依照。而糞便中甲肝 病毒的檢出則是該病人擁有傳染性的靠譜依照。因?yàn)椴《倔w積細(xì)小、生命形式 不完美，這使得一般顯微鏡和無(wú)生命培育基在病毒查驗(yàn)中無(wú)用武之地?？捎玫?查驗(yàn)方法有：2/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展血清學(xué)方法、電鏡察看與分別培育（用動(dòng)物接種、組織培育、細(xì)胞培育 等）等。臨床上常常采納免疫學(xué)方法進(jìn)行快速診療，且正確性和敏捷度都較 Wj 電子顯

6、微鏡或分別培育的方法比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)事，常常在研究中采納。.大便寄生蟲(chóng)查驗(yàn)在目視檢查和顯微鏡檢查中，已經(jīng)有大多數(shù)寄生蟲(chóng)感染能被檢出?？墒?， 因?yàn)橄x(chóng)卵和蟲(chóng)體在糞便中的散布高度不均一，使得目視檢查和一般的涂片鏡檢 結(jié)果重復(fù)性很差。在高度思疑寄生蟲(chóng)感染的病例，應(yīng)采納集卵法以及蟲(chóng)卵孵化 實(shí)驗(yàn)等以提升檢出率和重復(fù)性。.大便的零落細(xì)胞查驗(yàn)在下消化道腫瘤時(shí)，腫瘤表面細(xì)胞會(huì)零落并隨糞便清除，在糞便中發(fā)現(xiàn)腫 瘤細(xì)胞能夠確診某些下消化道的腫瘤?？墒?，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的零落擁有隨機(jī)性， 且細(xì)胞量極少、取材難，因此檢出率不高。此外，上消化道腫瘤的零落細(xì)胞因 為經(jīng)過(guò)胃腸道的消化作用，難以被檢出。這使得用慣例的方法進(jìn)行大便零落細(xì)

7、 胞查驗(yàn)的適意圖義不大?？偟膩?lái)說(shuō)，大便查驗(yàn)的好多方法都已經(jīng)很成熟和規(guī)范化、規(guī)程化。有關(guān)的 查驗(yàn)操作及查驗(yàn)結(jié)果的臨床意義請(qǐng)拜見(jiàn)臨床查驗(yàn)操作規(guī)程以及有關(guān)教材。 本章主要介紹目前一些比較新的查驗(yàn)方法在大便查驗(yàn)中的應(yīng)用及所帶來(lái)的診療 意義。第二節(jié)大便隱血實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展隱血實(shí)驗(yàn)是指檢查胃腸道隱性出血的一類實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)胃癌和大腸癌等消 化道腫瘤，連續(xù)的消化道出血可能是其初期出現(xiàn)的獨(dú)一特色，且大便隱血檢查 屬無(wú)創(chuàng)檢查，試驗(yàn)方便、花費(fèi)便宜，合適進(jìn)行長(zhǎng)久察看，因此大便隱血試驗(yàn)則 目前依舊是初期發(fā)現(xiàn)的較好試驗(yàn)。傳統(tǒng)的隱血實(shí)驗(yàn)是利用血液中 RBC的血紅蛋白的亞鐵血紅素?fù)碛蓄愡^(guò)氧化 物酶作用，能分解H2O2為水和活性氧而

8、設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)略化學(xué)試驗(yàn)。這種方法固然成 本便宜、簡(jiǎn)單易行，但特異性差、敏捷度較低，易受食品及服用藥物成分的影3/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展響。為解決傳統(tǒng)隱血試驗(yàn)的特異性問(wèn)題，人們探究了一些新的隱血試驗(yàn)方法， 好像位素鋁（51Cr）法等同位素法和各樣免疫學(xué)方法。一、同位素方法（一）銘（51Cr）法測(cè)定大便隱血量.原理51Cr-紅細(xì)胞經(jīng)靜脈注射后，正常不進(jìn)入消化道，消化道出血時(shí)則進(jìn)入其實(shí)不被吸 收,隨大便排出。將大便中的放射性與每毫升血液中放射性比較計(jì)算可求出胃腸 道出血量。.方法脈注射51Cr-RBC7.4MBq后，采集72小時(shí)大便，稱重測(cè)放射性，并在開(kāi)始時(shí)和采集大便結(jié)束時(shí) 抽靜脈血測(cè)每毫升放射性計(jì)數(shù)。按公

9、式計(jì)算結(jié)果。72H出血量（ml）=大便總放射性/每毫升血放射性（二）胃腸道出血的得標(biāo)的紅細(xì)胞法定位診療.原理當(dāng)胃腸道出血時(shí)，得標(biāo)的紅細(xì)胞或膠體隨血液進(jìn)入胃腸道。.方法靜脈注射顯像劑后以2-5分鐘一幀的速度連續(xù)顯像0.5-1小時(shí)，必需時(shí)延緩顯像。但膠體不可以進(jìn)行延緩顯像。.臨床應(yīng)用適應(yīng)于活動(dòng)胃腸道出血的診療和大概定位。急性活動(dòng)出血用得標(biāo)膠體顯像，間歇出血者用得標(biāo)RBC顯像。診療正確率在 80%左右，能夠探測(cè)出血率高于每分鐘4/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展0.1ml的消化道出血。只管同位素方法的敏捷度和特異性無(wú)可厚非，甚至還能夠?qū)Τ鲅c(diǎn)進(jìn)行正 確的定位，但臨床很難接受將一種應(yīng)用放射性同位素的、操作復(fù)雜的、需

10、要特 別儀器的方法廣泛用來(lái)進(jìn)行一個(gè)沒(méi)有特異性的指標(biāo)的查驗(yàn)。二、免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法以其特異性和敏捷度而廣受臨床查驗(yàn)的歡迎。鑒于免疫反響的 隱血實(shí)驗(yàn)方法是目前發(fā)展最快也最有臨床適用價(jià)值的隱血實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用免疫 學(xué)方法的隱血實(shí)驗(yàn)擁有很好的敏捷度，一般血紅蛋白為0.2mg/L 或0.03mg/g糞便即可獲取陽(yáng)性結(jié)果，且有很高的特異性，各樣動(dòng)物血血紅蛋白 在500mg/L、辣根過(guò)氧化物酶在 2000mg/L時(shí)不會(huì)出現(xiàn)擾亂，因此不需控制飲食。依據(jù)文件報(bào)導(dǎo)，有三類抗體可用于糞便的隱血實(shí)驗(yàn)：一種為抗人血紅蛋白抗體，一種抗人紅細(xì)胞基質(zhì)抗體，另一種為抗血液中其余成分如a1-AT、Tf、Hb-Hp等。采納抗a1-

11、AT、Tf、Hb-Hp等抗體的隱血實(shí) 驗(yàn)對(duì)所有消化道出血均呈陽(yáng)性反響；而抗人血紅蛋白法和抗人紅細(xì)胞基質(zhì)法隱血試驗(yàn)主要檢測(cè)下消化道出血，約有 40-50%的上消化道出血不可以檢出，原由是：血紅蛋白或紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化酶降解就業(yè)性或消化殆盡已不擁有本來(lái)免 疫原性；過(guò)度大出血而致反響系統(tǒng)中抗原剩余出現(xiàn)前帶現(xiàn)象；病人血紅蛋白的抗原與xx抗體不配。所以，抗人血紅蛋白法或抗人紅細(xì)胞基質(zhì)的隱血試驗(yàn)?zāi)壳氨灰詾槭菍?duì)大腸 癌普查最合用的試驗(yàn)。為了使免疫學(xué)方法在檢測(cè)糞便潛血時(shí)盡可能簡(jiǎn)易，以適 應(yīng)大規(guī)模大腸癌普查的需要和臨床快速報(bào)告的要求，有的企業(yè)已經(jīng)推出單克隆 抗體一步法試驗(yàn)，如美國(guó)萬(wàn)華普曼生物工程有限企業(yè)。他們所采納

12、的糞便潛血5/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展免疫一步法是一種快速簡(jiǎn)易，無(wú)嗅無(wú)味的三明治夾心免疫查驗(yàn)法。擁有特異性 強(qiáng)、高靈每度（0.03mgHb/g糞）、查驗(yàn)快速（1 - 5分鐘）、便操作簡(jiǎn)單（一步查驗(yàn)）、試 劑易保存（室溫）和結(jié)果簡(jiǎn)單易讀的長(zhǎng)處，在診療和治療惹起腸胃道出血的疾病有重要意義。特別是消化道癌腫患者87%便隱血為陽(yáng)性?？墒?，據(jù) Herzog和Cameron等研究，正常人24小時(shí)胃腸道生理性失血量為0.6ml,因?yàn)槊庖邔W(xué)方法的高度敏感性，在某些正常人特別是服用刺激備用 腸道藥物后或處于應(yīng)急反響狀態(tài)時(shí)也可能造成假陽(yáng)性。三、其余方法最近幾年來(lái)某些實(shí)驗(yàn)室還采納嚇咻熒光法血紅蛋白定量試驗(yàn)，用蟄草酸試 劑

13、使血紅素變成嚇咻進(jìn)行熒光檢測(cè)，這樣除可測(cè)糞澡未降解的血紅蛋白外，還 可測(cè)血紅素衍化物嚇咻，進(jìn)而戰(zhàn)勝了化學(xué)法和免疫法受血紅蛋白降解影響弊端， 可對(duì)上、下消化道出血相同敏感，但外源性血紅素、嚇咻類物質(zhì)擁有擾亂性， 且方法較復(fù)雜，故不易推行使用。第三節(jié)糞便基因查驗(yàn)的研究進(jìn)展最近幾年來(lái)，大腸癌發(fā)病率有上漲趨向，全球每年新增病例高達(dá)57萬(wàn)，占所有確診癌癥的4%1 o大腸癌的癥狀體征均無(wú)特異性，以致臨床上確診的大腸癌大 多數(shù)為中、后期，臨床治療成效差，5年生計(jì)率極低。如能初期診療出大腸癌，可使90%以上的患者獲取治愈。所以，大腸癌的挑選診療工作特別重要。既往應(yīng)用最廣泛的挑選檢查是大便潛血實(shí)驗(yàn)（FOBT ）

14、,固然FOBT在挑選大腸癌方面獲得一些進(jìn)展，但有很高的假陽(yáng)性率和假陰性率。纖維結(jié)腸鏡檢查是檢出大腸癌的靠譜方法，但該方法為侵入性且需要必定的設(shè)施和儀器，操作要求也 較高，目前尚不可以用于大范圍人群挑選普查。腫瘤標(biāo)志物檢查，如癌胚抗原（CEA）、CA19-9及腫瘤有關(guān)抗原T、Tn及TAG-T2等，固然對(duì)大腸癌的臨床 診療及預(yù)后判斷有幫助，但對(duì)初期大腸癌診療的特異性及敏感性均不高。跟著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生發(fā)展歸因于有關(guān)基因突變，而糞便中 的零落細(xì)胞包含著與大腸癌關(guān)系親密的突變基因，糞便中基因檢測(cè)可望成為挑 選診療大腸癌的新方法。6/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展一、糞便基因篩檢的分子生物學(xué)基

15、礎(chǔ)分子生物學(xué)研究表示，腫瘤的產(chǎn)生是多能干細(xì)胞向正常細(xì)胞增殖、分化的 過(guò)程中，受環(huán)境要素和遺傳要素的影響，有關(guān)基因發(fā)生改變的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞 的基因與基因表達(dá)與正常細(xì)胞有明顯差別，所以如能檢出這種基因改變就能為 腫瘤的診療和預(yù)防供給條件。腫瘤不是單基因疾病，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤有 關(guān)基因的多階段累積的改變過(guò)程，波及到多種癌基因激活和多種抑癌基因失活。 如能在初期檢出基因突變信息，就能夠獲取細(xì)胞癌變的信號(hào)，進(jìn)而對(duì)腫瘤的初期診療和預(yù)防帶來(lái)踴躍意義。目前以為一種腫瘤的產(chǎn)生需要 45個(gè)有關(guān)癌基因 的改變；與大腸癌有關(guān)的癌基因主要有 ras、c-myc、-erb2等，與大腸癌有關(guān)的抑 癌基因主要有APC/M

16、CC、DCC、p53及RB等。在大腸癌形成過(guò)程中，ras、c-myc癌基因和APC、MCC抑癌基因的改變是初期事件。Ras基因改變主要發(fā)生在12、13或16密碼子，大概50%的大腸癌和50%的大腸腺癌（直徑 1cm） 發(fā)現(xiàn)有ras基因突變。等位基因的丟掉最常有于17p染色體等位基因的缺失。雖然這種缺失在大腸腺瘤的各個(gè)期間都極少見(jiàn)到，但有人發(fā)現(xiàn)17p等位基因丟掉與腺瘤向癌轉(zhuǎn)變有關(guān)。17p染色體等位基因丟掉的常有部位為 p53基因，K-ras、p53基因是人類癌癥最常有的突變基因，二者的檢出對(duì)大腸癌的診療很 有幫助。包含APC基因和MCC基因的5q等位基因的缺失占發(fā)散性大腸癌的 35%。這些基因的

17、特異性改變可成為診療腫瘤的標(biāo)志。人們很早就發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸粘膜上皮不停零落入腸腔隨糞便排出，其更新周期約 為每小時(shí)1%,整個(gè)大腸粘膜約34天即可從頭改換一次，而生長(zhǎng)旺盛的腫瘤 組織更新更快。固然這些粘膜細(xì)胞零落伍很快從糞便中排出，但因?yàn)榧S便物質(zhì)的 存在，用零落細(xì)胞學(xué)手段難以發(fā)現(xiàn)異樣細(xì)胞。要進(jìn)行細(xì)胞學(xué)剖析，只有從直腸、 結(jié)腸的灌洗液中才能獲取比較潔凈的細(xì)胞，這無(wú)疑又增添了方法的難度和病人的 難過(guò)。但是，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)糞便中的有關(guān)基因突變，則不受糞便其余 物質(zhì)的影響，且能夠批量篩查，可望稱為大腸癌的挑選和初期診療的一種敏感而 有效的方法。7/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展二、糞便基因突變檢測(cè)方法Sidran

18、sky于1992年初次論述能夠從大腸癌糞便零落細(xì)胞檢出K-ras基因突變，但他所采納的方法比較復(fù)雜，因此不可以用于慣例例行診療。目前檢測(cè)糞 便基因突變的方法主要有：(1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)(IHC );Southern印跡雜交；DNA直接測(cè)序；PCR產(chǎn)物單鏈DNA泳動(dòng)變位技術(shù)和錯(cuò)配 PCR技術(shù)。傳統(tǒng)的 Southern 印跡雜交和DNA直接測(cè)序，固然可正確地確立突變的種類及部位，但操作復(fù)雜、 技術(shù)要求高、時(shí)間長(zhǎng)、花費(fèi)較高，不適用于臨床篩檢基因突變。目前多采用的是免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌有關(guān)基因產(chǎn)物，如檢測(cè)p53蛋白、ras基因的p21蛋白及c-mye的p62蛋白。固然該技術(shù)簡(jiǎn)單，但有相當(dāng)一部分基因改

19、變檢測(cè)不到，且運(yùn)用不一樣的抗體需要不一樣的解說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)，臨床意義也不一樣。Soong等用IHC檢測(cè)p53蛋白和用PCR-SSCP檢測(cè)p53基因突變發(fā)現(xiàn)，IHC對(duì)大腸癌的p53蛋 白檢測(cè)率為23% ,而PCR-SSCP剖析技術(shù)檢出p53基因突變率為39% ,二者的切 合率為68% ,不切合率為32% ,說(shuō)明p53蛋白累積不可以代表有 p53基因突變，反之亦然。Hall等也以為p53蛋白免疫組化陽(yáng)性其實(shí)不必定是突變的 p53累積，還 可能是穩(wěn)固的野生型p53蛋白在起作用。因?yàn)楫?dāng)正常細(xì)胞的 DNA受傷害時(shí)，野生 型p53蛋白也會(huì)過(guò)度表達(dá)。在其余種類的癌組織中也發(fā)現(xiàn) p53蛋白增添并無(wú)相應(yīng)的 p53基因突

20、變。PCR及其有關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展也為快速、簡(jiǎn)易、敏捷地挑選突變基因帶來(lái) 了可能。此中 PCR產(chǎn)物的單鏈 DNA泳動(dòng)變位技術(shù)(mobilityshifts )在診療基因 突變方面有滿意的敏感性(90%100%)并能挑選大批樣本。該技術(shù)包含變性梯度凝膠電泳(DCGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、限制性片段多態(tài)性剖析(RFCP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性剖析(SSCP),此中，DGGE和TGGE法價(jià)錢昂 貴，其臨床應(yīng)用受限制。糞便查驗(yàn)及進(jìn)展8/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展目前，PCR-SSCP是最受重視的剖析技術(shù)，該技術(shù)利用相同長(zhǎng)度的單鏈DNA在非變性的凝膠電泳中不一樣遷徙地點(diǎn)僅取決于單鏈二級(jí)空間構(gòu)象一一堿基擺列構(gòu)

21、造，進(jìn)而將突變基因片斷與正?；蚱瑪鄤澐珠_(kāi)來(lái)。其長(zhǎng)處為：(1)操作簡(jiǎn)單，不需要特別儀器，技術(shù)簡(jiǎn)單掌握;(2)實(shí)驗(yàn)周期短，最快可在 24小時(shí)內(nèi)獲取檢測(cè)結(jié)果，其實(shí)不受 PCR擴(kuò)增差 錯(cuò)的影響；(3)不單可檢查出單堿基置換，還可檢出數(shù)個(gè)堿基插入或缺失；(4)可彩非放射性同位素標(biāo)志，使其更簡(jiǎn)單在臨床上推行使用。日本學(xué)者Equchi于1996年開(kāi)始對(duì)糞便標(biāo)本中的p53基因進(jìn)行PCR-SSCP剖析，結(jié)果發(fā)此 刻11例有p53基因突變的手術(shù)標(biāo)本中有 7例在糞便中查出p53基因突變；在5例潛血試驗(yàn)阻性的病人中有 3例糞便標(biāo)本檢出p53基因突變，故以為利用 PCR- SSCP 對(duì)糞便腫瘤物異的基因突變進(jìn)行剖析可

22、在臨床推行應(yīng)用。但該技術(shù)易產(chǎn)生 假阻性，為其不足之處。這可能是因?yàn)樵跀U(kuò)增的片斷中，大多數(shù)為正常的基因片段，突變的基因片段較少，所以在電泳泳動(dòng)變位上顯示不好。為了確立PCR-SSCP 檢測(cè)的敏感性，Silvano等將腫瘤細(xì)胞混以正常細(xì)胞，濃度挨次由0%-90%遞加，而后進(jìn)行 PCR-SSCP剖析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)彩放射性標(biāo)志時(shí)腫瘤細(xì)胞濃度須達(dá)5%, PCR-SSCP剖析才能檢出p53基因突變，而當(dāng)用非放射性標(biāo)志時(shí)腫瘤細(xì)胞 濃度一定達(dá)到10%-15%才能顯示出陽(yáng)性結(jié)果。在大腸癌患者糞便中，特別是初期癌患者的糞便中，正常的 DNA片斷常高出異樣DNA片段100-1000倍，使用SSCP剖析時(shí)腫瘤有關(guān)基因的

23、泳動(dòng)變位不清楚。近來(lái)年常有人彩特異等位基因 PCR擴(kuò)增(ASA)能夠解決這一難題。其主要 原理是當(dāng)異性引物與模板之間出現(xiàn)錯(cuò)配(mismatch ),特別是3尾端堿基與模板之間出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)，因?yàn)?TagDNA聚合酶缺少3 -5核酸外切酶活性，所以對(duì)錯(cuò) 誤配對(duì)的堿基不可以進(jìn)行改正，故該引物的PCR擴(kuò)增速率將急劇降落甚至擴(kuò)增中止。有人設(shè)計(jì)出一個(gè)能與突變體基因片段正常配對(duì)而與正常片斷錯(cuò)誤配對(duì)的引物，主假如在3尾端的堿基進(jìn)行改正。該方法的長(zhǎng)處是敏感性、特異性很高， 能夠從100個(gè)正常和不正常細(xì)胞中檢出一個(gè)突變細(xì)胞。另I的，該技術(shù)不需要限9/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展制性酶消化及與特異性等位基因相聯(lián)合的寡核昔酸，也

24、不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序剖析。由該原理還可產(chǎn)生其余方法，如misnatched PCR ARMS(amplificationrefraitorymulation system) 、 mutent enriched PCR。該技術(shù)對(duì)單基因疾病如遺傳病 成效好，但腫瘤波及到多基因改變，而且每個(gè)基因有多種突出，比如p53突變種類達(dá)350種，所以目前該技術(shù)主要應(yīng)用于對(duì)K-ms基因突變的檢測(cè)。因?yàn)?K-ms基因的突變幾乎老是發(fā)生于三個(gè)密碼中的一個(gè)，所以設(shè)計(jì)檢出K-ms基因的敏感試驗(yàn)要設(shè)計(jì)檢出其余腫瘤有關(guān)基因改變要簡(jiǎn)單得多。德國(guó)學(xué)者Nollaan于1996年彩突變體富集PCR技術(shù)檢測(cè)糞便中K-ms基因的

25、12、13密碼子的基因改變，16例大腸癌手術(shù)標(biāo)本經(jīng)用 PCR-SSCP剖析后證 明無(wú)K-ms突變的病人糞便中，經(jīng)突變體富集 PCR技術(shù)檢測(cè)有2例K-ms突變，經(jīng) 過(guò)敵手術(shù)標(biāo)本再次作 PCR-SSCP剖析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，確有1例手術(shù)標(biāo)本中有K-ms突 變。該作者以為該技術(shù)擁有簡(jiǎn)易、敏捷性、特異性高等長(zhǎng)處，臨床上可用于檢測(cè)糞 便中的K-ms突變，有助于大腸癌的初期診療。除在糞便中檢出基因突變以期初期診療大腸癌外，人們還開(kāi)始在尿液、胰 液、痰液、支氣管腫泡灌洗液、CSF等排泄物、分泌物中查找有關(guān)基因突變，以便能初期診療有關(guān)部位癌癥。相信跟著技術(shù)的改良，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)腫瘤特異性基因?qū)⒊蔀樵\ 療腫瘤的

26、重要方法。第四節(jié)糞便查驗(yàn)的新思路免疫學(xué)、分子生物學(xué)等新技術(shù)的引入給糞便查驗(yàn)帶來(lái)了嶄新的查驗(yàn)手段， 這使得臨床糞便查驗(yàn)技術(shù)獲取了快速的發(fā)展?？墒牵徽撌敲庖邔W(xué)方法仍是分 子生物學(xué)技術(shù)，都是擁有很強(qiáng)的查驗(yàn)?zāi)康尼槍?duì)性的方法，難以經(jīng)過(guò)一次或幾次 實(shí)驗(yàn)就解讀出病人糞便中所包含的消化功能、新陳代謝、菌群雜亂以及腫瘤等 豐富的生理、病理信息。換言之，這些方法在為大便查驗(yàn)帶來(lái)高特異性的同時(shí)， 也拋棄了大批的、可能極有價(jià)值的信息。有沒(méi)有特異而又擁有高通量的方法呢？10/12糞便查驗(yàn)及進(jìn)展一、基因芯片技術(shù)基因芯片的觀點(diǎn)來(lái)自于計(jì)算機(jī)芯片，其實(shí)質(zhì)是在面積不大的基質(zhì)表面有序 地?cái)[列了大批可尋址的辨別分子。詳細(xì)地說(shuō)，就是

27、在玻璃、硅等載體上有序 地、高密度地(點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離一般小于500)擺列、固定了大批的靶基因片段(也叫探針?lè)肿?。這些被固定的探針?lè)肿釉诨|(zhì)上就形成了高密度DNA微陣列所以，基因芯片(GeneChip )也叫基因微矩陣(GeneMicroarray )。由上邊的基因芯片的定義能夠看出，基因芯片技術(shù)實(shí)質(zhì)上是一種高度集成 的基因探針雜交技術(shù)。它既承繼了DNA探針雜交技術(shù)的高特異性，又具備了同時(shí)檢測(cè)多靶基因的實(shí)驗(yàn)高通量的特色。固然基因芯片擁有另人激勵(lì)的優(yōu)勝性，但因?yàn)樗允且环N嶄新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 目前還沒(méi)有來(lái)得及應(yīng)用到大便查驗(yàn)上來(lái)。就目前的技術(shù)來(lái)看，設(shè)計(jì)一張集成有 消化道腫瘤基因辨別譜、消化道病毒基因

28、辨別譜、消化道常有致病菌基因辨別 譜、消化道寄生蟲(chóng)基因辨別譜的“大便查驗(yàn)基因芯片”并無(wú)技術(shù)上的困難，不過(guò)目前基因芯片的成本太高，實(shí)驗(yàn)方法也略顯煩雜。但跟著大規(guī)模應(yīng)用后成本的降低和實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)一步改良，出現(xiàn)可應(yīng)用于臨床的“大便查驗(yàn)基因芯片”是早晚的事。自然，我們不可以悲觀等候，我在此說(shuō)起基因芯片技術(shù)，就是希 望各位能在這方面作些工作，加速臨床糞便查驗(yàn)技術(shù)進(jìn)步的步伐。二、色、質(zhì)譜剖析基因芯片等新興技術(shù)固然給腫瘤、病原體等有生命的病原帶來(lái)了查驗(yàn)手段 的打破，可是，關(guān)于胃腸道功能、胰腺功能等消化功能的查驗(yàn)就力所不及了。 所以，我們?cè)谯x躍采納新技術(shù)的同時(shí)，也不要忘掉成熟技術(shù)的新應(yīng)用。色譜法是一種經(jīng)典的分別技術(shù)，它利用因混淆物各組分在性質(zhì)與構(gòu)造上的 差別而在流動(dòng)相攜帶混淆物流經(jīng)固定相時(shí)，混淆物中各組分與固定相互相作用 的強(qiáng)弱而實(shí)現(xiàn)混淆物各組分的分別。依據(jù)流動(dòng)相的不一樣，色譜法又成立氣象 色譜和液相色譜。質(zhì)譜法是