酶以及細胞固定化

1、關于酶及細胞固定化第一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術第二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月隨著固定化技術的發(fā)展，作為固定化的對象不一定是酶，也可以是微生物細胞、植物細胞、動物細胞或細胞器。此外，固定化生物催化劑的研究還發(fā)展到多酶體系的固定化，以及帶有ATP、NAD(P)這一類輔酶的復合酶反應系的固定化。第三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概述一、 固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點： 多次使用 可以裝塔連續(xù)反應 純化簡單 提高產(chǎn)物質量 應用范圍廣缺點： 首次投入成本高 大分子底物較困難第四張，PPT共七

2、十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、 固定化的原則酶催化作用依靠它的高級結構及活性中心，固定化時活性中心的必需基團應避免參加反應；避免高溫、強堿、有機溶劑以及高濃度鹽的處理，保護靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質的高級結構。盡可能在溫和條件下進行固定化反應。 第五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、固定化酶的性質及其影響因素(一) 影響固定化酶性質的因素1 酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2 載體的影響（1） 分配效應（2） 空間障礙效應（3） 擴散限制效應3. 固定化方法的影響第六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)

3、固定化后酶性質的變化1. 酶活性下降： (1)酶活性中心的重要氨基酸與水不溶性載體相結合； (2)當酶與不溶性載體相結合時，它的結構起了變化； (3)酶被結合后雖不失活，但酶與底物的相互作用受到空間位阻。 前二種可用適當條件加以克服，而第三中則無法克服了。至于包埋法固定化酶的活性下降，可能是因為固定化過程中酶有些變化或者底物和產(chǎn)物對凝膠的滲透力較小之故。第七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2 對酶穩(wěn)定性的影響操作穩(wěn)定性提高貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。對分解酶的穩(wěn)定性提高。對變性劑的耐受力升高原因:固定化后酶分子與載體多點連接。酶活力的釋放是緩慢

4、的。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。第八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3固定化酶pH的變化載體帶負電荷，pH向堿性方向移動； 載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。產(chǎn)物性質對pH的影響催化反應的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低第九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4 最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。5 底物特異性變化作用于低分子底物的酶 特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會變化。第十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6 米氏常數(shù)Km隨載體性質變化由于分配效應：=Si微環(huán)境/S宏觀環(huán)境

5、Km=Km/(表觀米氏常數(shù))（1） 載體與底物帶相同電荷，SiS,Km固 定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，SiS，則 1,KmKm對簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動力學性質一般服從米氏方程：第十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月四、評價固定化酶的指標1酶活定義（IU)：在特定條件下，每分鐘催化一微摩爾底物轉化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活單位。 計量單位酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位 品質的體現(xiàn)第十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶

6、活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標。連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）3.4. 或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分數(shù)。5. 相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力第十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、 固定化酶的活力測定方法1. 振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液， 一邊振蕩或攪拌，一邊進行催化反應 取出一定量的反應液進行酶活力測定。2. 酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應柱中 讓底物溶液以一定的流速流過酶柱 收集流出的反應液 測定其中

7、產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量。3. 連續(xù)測定法：利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。 第十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 固定化酶的制備（一）吸附法（二）結合法（三）交聯(lián)法（四）包埋法（entrapping method）第十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一） 吸附法-物理吸附法（1）常用載體無機物有機物高分子化合物活性炭、白陶土、氧化鋁、多孔玻璃、硅膠、碳酸鈣凝膠淀粉麩質、大孔樹脂、DEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠（2）固定化酶的制備機理所用載體具有活性，可

8、將酶吸附到載體上。（3）優(yōu)缺點 優(yōu)點：酶蛋白活性中心不易被破壞，完整保持酶的 高級結構;方法簡單，成本低。 缺點：酶吸附不牢固，易脫落； 防止吸附酶的蛋白質與載體發(fā)生變性反應第十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一） 吸附法-離子鍵結合法酶與具有離子交換基團的不溶性載體結合形成固定化酶（1）所用載體纖維素的衍生物，離子交換樹脂（2）固定化酶的制備機理酶蛋白的帶電基團和含有離子交換基團的固相載體之間由于靜電相吸而形成絡合物，使酶吸附到離子交換劑上。（3）優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，處理條件溫和，酶的高級結構 和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶缺點：載體與酶的結合力較弱，在高離子強度下

9、酶易從載體上脫落第十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)共價鍵結合法 酶與不溶于水的載體以共價鍵形式結合制備固定化酶的方法。即，通過化學共價鍵，把與酶蛋白活性無關的氨基酸功能基團連接在不溶于水的載體上。1. 酶與載體反應的主要功能基團游離羥基：肽鏈C末端的羧基、天門冬酰氨酸、 谷氨酸的羧基 游離氨基：肽鏈N末端的氨基、賴氨酸氨基巰基：半胱氨酸羥基：絲氨酸、蘇氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：組氨酸第十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 載體活化的方法A重氮法B疊氮法C烷基化反應法D硅烷化法E溴化氰法第二十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月A重氮法反應示意式如下： 亞硝

10、酸重氮化與酪蛋白反應第二十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月A重氮法目前在我們國內用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基反應式及原理：第二十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月A重氮法例5-磷酸二酯酶的固定化此酶用來降解核酸，可分離得到四個5-單核苷酸；對- -硫酸酯乙砜基胺（SESA）作為雙功能試劑，將酶共價結合到多糖載體上；本成果榮獲國家發(fā)明三等獎，中國科學院上海生化研究所袁中一等，我國第一個用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶） 第二十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月B 疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物

11、制備固定化葡萄糖淀粉酶步驟如下： 酯化：CM-纖維素先洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴中通入HCl氣體，進行酯化反應；然后洗滌，空氣干燥。 肼解。把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應1小時，過濾，洗滌干燥。 疊氮化。肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，攪拌滴加9ml 3% NaNO2反應20min，過濾用冷蒸餾水洗滌，同時加酶。 (4) 偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載體加入0.05N pH 8.0 磷酸緩沖液（內含250-500mg酶），5攪拌2-3小時，過濾，用 0.001N HCl，水洗滌，即為固定化葡萄糖淀粉酶（凍干保存）。 第二十四張

12、，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月將與載體反應的功能基團與各種重氮化劑、烷化劑等反應形成共價鍵制備固定化酶。纖維素+鹽酸甲醇CMC甲酯肼CMC酰肼CMC疊氮化物NH2酶亞硫酸鈉鹽酸固定化酶CH2CO-NH酶CMCCH2COOH制備酰肼疊氮化物羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序纖維素羧甲基化羧甲基纖維素第二十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月C烷基化反應法第二十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月D硅烷化法一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特點：機械強度好，表面積大。耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。 第二十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于

13、2022年6月E 溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。第二十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）交聯(lián)法制備固定化酶概念：雙功能試劑或多功能試劑與酶蛋白質中的氨 基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)， 凝集成固定化酶1、發(fā)生作用的氨基酸殘基： 酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巰基 N末端的a氨基。2、常用的雙功能或多功能試劑： 戊二醛 聚甲叉雙碘乙酰胺 雙重氮聯(lián)苯胺第二十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 先將酶吸附在不溶于水的載體上，再用雙功能試劑 戊二醛與酶蛋白的氨基之間交聯(lián)起來，形成酶網(wǎng)包圍在 載體表面。 常用載體：硅膠、離子交

14、換樹脂。第三十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（四） 包埋法制備固定化酶 酶本身不參與反應，僅用物理方法把酶包埋在凝膠細小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中。包埋方法有兩種：1 格子型固定化酶2 微型膠囊法（1）原理 以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂等材料，在酶存在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細小多孔的網(wǎng)狀格子中。反應為厭氧反應。第三十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶液丙烯酰胺N，N雙丙烯酰胺氫氣催化劑：四甲基乙二胺、明礬胺引聚劑：過硫酸鉀、核黃素光照聚合反應凝膠酶塊固定化酶切割（2）方法（以丙烯酰胺為材料是最常用的方法）第三十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月

15、第三十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2 微型膠囊法（1）原理 把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球狀含酶微型膠囊。（2）特點微囊直徑幾微米幾百微米。低分子底物可以自由通過并進入微囊內。與酶反應后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物質不能通過微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質也無法進入微囊內第三十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月以親水性單體和疏水性單體在表面發(fā)生聚合反應將酶包圍起來，形成微型膠囊酶。分三步：常用形成膠囊的材料和生成的聚合物種類：親水性單體疏水性單體生成的聚合物聚胺聚異氰衍生物聚胺、聚酯乙二醇、多元醇聚異氰衍生物聚胺、聚酯3. 表

16、面聚合法制備微型膠囊第三十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月A 乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。B 表面聚合：將含有疏水性單體的有機溶媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。三步：C 清洗：反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的剩余單體1表面聚合法第三十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月各類固定化方法的特點比較: 比較項目吸附法結合法 交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價鍵結合離子鍵結合 制備難易易難易 較難較難固定化程度弱強中等 強強活力回收率較高低高 中等高載體再生可能不可能可能 不可能不可能費用低高低 中等低

17、底物專一性不變可變不變 可變不變適用性酶源多較廣廣泛 較廣小分子底物、藥用酶第三十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 固定化細胞固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的酶不經(jīng)過分離提純 ，直接用適當?shù)姆椒▽⒕w加以固定 來催化各種特定的生物化學反應。優(yōu)點：不需提制酶，可保持酶的活性。反復使用，成 本低與固定化酶比較制備方法：與固定化酶相同，有包埋法、載體結合法 、交聯(lián)法、熱處理法、射線處理法。 其中包埋法是最理想的方法。第三十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一 包埋法1 原理 在菌體細胞本身不發(fā)生化學反應的情況下，將其 包進半透性的多聚物膜內。小分子的底物和產(chǎn)物均可 自

18、由出入，而菌體細胞卻不會漏出。2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂以制備含天門冬氨酸的大腸桿菌細胞為例將菌體細胞預先用生理鹽水懸浮，向懸浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，然后加入催化劑過硫酸胺和加速劑四甲基乙二胺，混勻后放置一定時間聚合。將得到的凝膠破碎即得到固定化細胞。收率達72.5第三十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二 載體結合法（吸附法）1 原理 微生物細胞表面帶有電荷，在適當?shù)臈l件下可以 與載體的離子交換基團形成絡合物或吸附在載體上。2 常用載體離子交換纖維素。陰離子樹脂、DEAE纖維素。3 優(yōu)缺點 優(yōu)點：方法簡單、載體易于再生。 缺點：結合力弱，菌體

19、細胞易脫落。第四十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月研究熱點光交聯(lián)樹脂包埋法 例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得第四十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 固定化原生質體和輔酶一 、原生質體固定化的方法制備原生質體將原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中配成原生質體懸浮液包埋法固定化原生質體。關鍵：原生質體如何制備？第四十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、原生質體的制備將對數(shù)生長期的細胞收集懸浮

20、在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中去細胞壁分離純化得到原生質體-活性鑒定第四十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、酶解注意要點1、酶解前要預處理：主要是為了使酶滲透到細胞器中去。采取的策略：先加入物質抑制或阻止某種細胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巰基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。2、酶系選擇：溶菌酶、蝸牛酶、葡聚糖酶、纖維素、半纖維素和果膠酶3、酶濃度選擇（0.5%-1%）4、酶解溫度和pH5、酶解終點確定第四十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月四、穩(wěn)定劑（高滲溶液）要求1.加入的化合物對細胞和原生質體無毒性2.不會影響水解酶的活性3.對代謝產(chǎn)物無不

21、良影響四、穩(wěn)定劑加入操作注意點1.一定pH （酶和菌體活性最高） 2.一定的濃度（過高濃度原生質體易脫水皺縮）3.種類：無機鹽-對細菌 有機物糖和糖醇-酵母4.易于滲入質膜、易于被原生質體和菌體分解的物質 不宜作為穩(wěn)定劑第四十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、原生質體細胞活性的檢測1 熒光素雙醋酸鹽（FDA) 染色法2 酚藏花紅染色法3 伊文思蘭染色法第四十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月六、輔酶固定化1、原因有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應(遞氫、遞電子或遞某些化學基團的作用）有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴工業(yè)上

22、應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生第四十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月輔酶固定化的方法：2、固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或將其進行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。3、輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。策略：先在輔酶的一定部位進行修飾-引入功能團和間隔臂（形成輔酶衍生物）- 再與水溶性高分子結合第四十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月輔酶的固定化第四十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月輔酶的固定化第五十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月輔酶再生的形式： 輔酶和酶共固定 與酶分子偶聯(lián)成輔酶-酶復

23、合物第五十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 固定化技術的應用生產(chǎn)果葡糖漿生產(chǎn)6-APA和抗生素生產(chǎn)乙醇和啤酒生產(chǎn)氨基酸生產(chǎn)蘋果酸生產(chǎn)淀粉酶第五十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)果葡糖漿利用葡糖異構酶是胞內酶的特性，可以直接將含酶的菌體細胞固定化，進行果葡糖漿(也稱高果糖漿)的工業(yè)生產(chǎn)。與以前采用水溶狀態(tài)的葡糖異構酶或含有此酶的微生物菌體的分批法相比，固定化生物催化劑連續(xù)生產(chǎn)法具有以下優(yōu)點：果葡糖漿質量均一；隨著異構效率的提高，甜度也增強；可以得到色淺、混濁度小的透明糖液；可以制得灰分少、純度高、風味佳的產(chǎn)品等。有關的固定化方法很多，曾報道過的有加熱固定法、離子

24、吸附法、絮凝法、包埋法、交聯(lián)法等。例如加熱法，將含葡糖異構酶的白色鏈霉菌的菌體細胞，在6065加熱處理10min，酶就固定在細胞內。此法簡便，成本低廉，工業(yè)上容易采用。 第五十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)6-APA和抗生素6-APA即6-氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉素酰胺酶的固定化細胞，可生產(chǎn)6-APA。例如，中國科學院微生物研究所和太原制藥廠曾研究采用各種不同的方法制備含青霉素酰胺酶的固定化細胞?？股厥且淮箢愔匾陌l(fā)酵產(chǎn)品，近年來在研究利用固定化菌體生產(chǎn)青霉素和桿菌肽方面也有所突破，引起了人們的注意。尤其是利用固定化細胞可以由單一營養(yǎng)物生成桿菌肽，

25、這是比傳統(tǒng)發(fā)酵法(用淀粉-肉湯培養(yǎng)基)優(yōu)越的地方。第五十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)乙醇和啤酒(一) 生產(chǎn)酒精酒精發(fā)酵需要大型發(fā)酵罐，不但設備繁雜，操作困難，而且耗費一部分糖以供酵母生長之用。自從應用固定化細胞進行連續(xù)發(fā)酵日益發(fā)展后，酒精發(fā)酵時間由傳統(tǒng)方法的36h縮短至3h以下，乙醇生產(chǎn)能力每小時為2050g/L，而傳統(tǒng)方法僅為2g/L。例如，千田一郎等將酵母固定于K-角叉菜膠，利用這種固定化增殖酵母可穩(wěn)定、連續(xù)生產(chǎn)一年以上，并且生產(chǎn)速率比以前的發(fā)酵法快10多倍。另外，關于細菌固定化的研究也頗為活躍，據(jù)Arcuri等報道，將運動發(fā)酵單胞菌用玻璃纖維吸附，使用由葡糖5-20%

26、及酵母膏0.5%配成的培養(yǎng)基，連續(xù)發(fā)酵28d，乙醇生產(chǎn)能力152g/Lh(停留時間為1015min)，這要比固定化酵母的乙醇生產(chǎn)能力大得多。第五十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)生產(chǎn)啤酒利用麥芽汁發(fā)酵生產(chǎn)啤酒，實際上是一種特殊類型的酒精發(fā)酵。近年來，利用固定化酵母細胞生產(chǎn)啤酒的研究已經(jīng)很多。例如，white等人報道了一個利用海藻酸鈣凝膠包埋非絮凝性細胞，連續(xù)生產(chǎn)啤酒的方法。Linko等人將酵母細胞固定于海藻酸鈣凝膠內，置于填充式柱式反應器內，用于由麥芽汁連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)啤酒，可維持幾個月，其麥芽汁在柱式反應器內的停留時間為2h，啤酒的酒精含量可達到4.5%。我國上海工業(yè)微生物所從

27、1979年起，也開始進行了固定化酵母細胞連續(xù)發(fā)酵啤酒的研究。第五十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)氨基酸(一)生產(chǎn)L-天門冬氨酸L-天門冬氨酸作為醫(yī)藥品、食品添加劑和甜味肽原料而被大量使用。目前用于生產(chǎn)L-天門冬氨酸的菌種都是大腸桿菌，固定化的方法以凝膠包埋法的效果較好。例如，千田一郎利用角叉菜聚糖凝膠包埋大腸桿菌，L-天門冬氨酸酶的活力比聚丙烯酰胺凝胺包埋法制得的固定化大腸桿菌的酶活力大大提高，而且用戊二醛、六甲叉二胺處理后，穩(wěn)定性明顯增加，其生產(chǎn)能力較聚丙烯酰胺包埋法的提高15倍。(二)生產(chǎn)L-丙氨酸例如，Yamamoto等利用K-角叉菜聚糖固定含L-天門冬氨酸-脫羧酶的德

28、阿昆哈假單胞菌，裝入柱式反應器，由L-天門冬氨酸連續(xù)生產(chǎn)L-丙氨酸。 第五十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)蘋果酸生產(chǎn)L-蘋果酸自1972年起，千田一郎等人利用聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨短桿菌，制成固定化細胞，實現(xiàn)了L-蘋果酸的連續(xù)、高效、大量、廉價的工業(yè)化生產(chǎn)。第五十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)淀粉酶利用聚丙烯酰胺凝膠包埋的枯草桿菌合成-淀粉酶，是固定化菌研究方面又一新進展。通過掃描式電子顯微鏡檢查得知，凝膠中的細菌在保溫過程中仍在生長，所以Kokubu等人認為，利用固定化菌體柱，在不久的將來進行-淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)是有可能的。可見，固定化技術在

29、工業(yè)上顯示出廣闊的應用前景。第五十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月在實際應用中需要考慮的一些重要因素主要有：(1)用于固定化的載體和試劑的成本；(2)固定化后酶的活力與回收率；(3)操作過程中固定化酶和固定化細胞的穩(wěn)定性；(4)在長時間使用后，固定化酶或固定化細胞的再生能力。目前，固定化增殖細胞方面的研究進展很快?？梢灶A期，在不久的將來有可能利用固定化微生物生產(chǎn)氨基酸、多肽、核苷酸、輔酶、乙醇、啤酒、抗生素、酶制劑、有機酸、激素等產(chǎn)品，這將使整個發(fā)酵工業(yè)和化學工業(yè)發(fā)生根本性的變革。第六十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶、固定化細胞反應器第六十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 固定化酶動力學在化學工程或催化反應工程上采用固定化酶，就其本質而言與傳統(tǒng)的固體催化劑一樣，但固定化酶的反應動力學和溶液酶的顯著不同，如酶的活力、反應動力學參數(shù)、底物專一性等都可能發(fā)生變化。這不僅是由于酶固定化后其結構可能發(fā)生了變化，而且是由于傳質阻力增大等原因所造成的。 第六十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶的反應歷程可以認為由以下5步組成：(1)底物由主體溶液傳遞到