固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用富集檢測1-羥基芘的方法研究

1、 固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用富集檢測1-羥基芘的方法研究 郭思依楊成Summary建立一種固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用富集檢測1-羥基芘的方法。通過優(yōu)化萃取溫度、萃取時間、攪拌速率、離子強度和靜態(tài)解吸時間等參數(shù)，得到石墨烯纖維對1-羥基芘萃取富集的最優(yōu)條件為30下以500rpm轉(zhuǎn)速萃取30min，加入氯化鈉濃度10%（W/V），并于200L甲醇中靜態(tài)解吸2min。1-羥基芘富集的回歸方程為Y=3.074106X+214 223，線性范圍為11 000pg/mL，LOD和LOQ分別為0.3pg/mL和1pg/mL，精密度為3.6%5.8%。實際樣品中1-羥基芘檢出濃度為5.6155.63pg/

2、mL，加標(biāo)回收率為80.8%105.2%，RSD值均小于10%，該方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。Key固相微萃取;高效液相色譜;1-羥基芘;富集：O657.63;TS255.7 ：A DOI：10.16465/431252ts.201909多環(huán)芳烴是一類芳香族環(huán)境致癌物，廣泛存在于大氣、土壤、水源以及食品中。食品受到環(huán)境污染或者不當(dāng)?shù)呐腼兎绞?，均會?dǎo)致多環(huán)芳烴的產(chǎn)生。人們通過呼吸、飲食等途徑接觸多環(huán)芳烴后令其參與人體代謝過程1-2。1-羥基芘是芘的代謝產(chǎn)物，人體代謝物中的1-羥基芘是多環(huán)芳烴的一個靈敏有效的生物監(jiān)測指標(biāo)3-4。1-羥基芘的檢測方法，主要采用高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FL

3、D）、液質(zhì)/氣質(zhì)聯(lián)用法等5-7。由于基質(zhì)的復(fù)雜性，因此在色譜檢測之前合適的前處理過程是十分必要的。目前報道的前處理方法有固相萃取、磁固相萃取、雙水相萃取等。丁昌明等8采用Envi-18固相萃取小柱對尿樣酶解液進行富集凈化，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測9種多環(huán)芳烴代謝物;黃維等9利用十八烷基膦酸改性的磁性介孔納米粒子為磁固相萃取介質(zhì)，對尿樣酶解液進行萃取，經(jīng)液相色譜分析;朱裕穗等10建立了乙腈-（NH4）2SO4雙水相提取，液相色譜-熒光檢測尿樣中羥基多環(huán)芳烴的方法，檢出限在0.062.32ng/mL。固相微萃取技術(shù)集采樣富集檢測于一體，過程更為簡單高效、綠色環(huán)保，但未見其對1-羥基芘的富集報道。文

4、章利用自制石墨烯固相微萃取纖維結(jié)合高效液相色譜富集檢測1-羥基芘。石墨烯表面的超大電子體系與1-羥基芘之間存在-共軛和疏水相互作用，可高效富集目標(biāo)物。1材料與方法1.1實驗材料1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)品和氯化鈉：上海阿拉丁試劑公司;甲醇為色譜純：賽默飛世爾科技（中國）有限公司;實驗用水為純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司;HP-2型-葡萄糖醛酸酶：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。取10mg 1-羥基芘溶于10mL甲醇中配成1 000mg/L標(biāo)品儲備液存于4冰箱，標(biāo)準(zhǔn)工作液由儲備液稀釋得到，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2 實驗儀器Waters e2695高效液相色

5、譜儀（配2475熒光檢測器）：美國沃特世公司;250L內(nèi)插管：安捷倫科技（中國）有限公司;ST3100實驗室pH計：奧豪斯儀器（常州）有限公司;DF-101S集熱式數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;5810R多功能臺式離心機：德國艾本德公司;SY-2230恒溫水浴搖床：上海珂淮儀器有限公司。1.3 高效液相色譜條件高效液相色譜檢測采用Waters e2695高效液相色譜儀（配2475熒光檢測器），進樣量20L，流速1mL/min，色譜柱：XBridge C18（4.6250mm，5m），柱溫25，流動相為水-甲醇（25：75，V/V）。激發(fā)波長（ex）345nm，發(fā)射波長（em

6、）388nm，等度洗脫15min。1.4 固相微萃取條件優(yōu)化吸取50L 1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)工作液至萃取小瓶中，用水稀釋至10mL，蓋上隔膜瓶蓋置于恒溫水浴鍋中?？疾燧腿囟龋?0，30，40，50，60），萃取時間（10min，20min，30min，40min，50min），攪拌速率（300rpm，400rpm，500rpm，600rpm，700rpm）、鹽離子濃度（0%、5%、10%、15%、20%，W/V）和靜態(tài)解吸時間（1min，2min，3min，4min，5min）對1-羥基芘富集效率的影響。萃取完成后，將纖維頭拉回進樣器內(nèi)，立即導(dǎo)入裝有200L甲醇的內(nèi)插管中靜態(tài)解吸后，進液相色譜儀進

7、行檢測，檢測流程見圖1。1.5 SPME-HPLC方法學(xué)評價為建立1-羥基芘富集標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL 1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)工作液進行最優(yōu)條件下的萃取富集實驗。LOD和LOQ分別以3倍、10倍S/N來計算;纖維萃取的重復(fù)性（日內(nèi)、日間精密度）是利用單根纖維分別重復(fù)萃取5次和3次得到。1.6 實際樣品的采集與處理收集5名大學(xué)生晨尿，于-20下保存。室溫下將尿樣自然解凍后搖勻，取10mL于50mL離心管中，加入0.2M鹽酸溶液，pH值調(diào)至5.0

8、，然后加入5mL pH值為5.0的醋酸鈉緩沖液和40L HP-2型-葡萄糖醛酸酶，充分混勻后在恒溫水浴搖床中于37下酶解4h。將酶解液經(jīng)0.45m濾膜過濾后，取1mL清液至萃取小瓶中用水稀釋至10mL進行SPME。2 結(jié)果與分析2.1 固相微萃取條件優(yōu)化2.1.1 萃取溫度本實驗考察了2060溫度下纖維對1-羥基芘的萃取效率變化，見圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，1-羥基芘的萃取效率在30下達到最大值。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，纖維對1-羥基芘的萃取量反而逐漸降低，表明纖維對1-羥基芘的吸附為放熱反應(yīng)，在較低溫度下達到平衡后，升高溫度導(dǎo)致分配系數(shù)降低從而使得1-羥基芘的萃取量逐漸減小。因此，萃取溫度選

9、擇在30下進行。2.1.2 萃取時間萃取時間可以顯著地影響萃取量，萃取時間的選擇是時間成本與分析方法靈敏度之間的折中。本實驗考察了萃取時間為1050min下纖維對1-羥基芘富集效率的影響，結(jié)果見圖3，隨著時間的延長，纖維對1-羥基芘的萃取量逐漸增大且在30min時基本達到萃取平衡，因此，選擇萃取時間為30min。2.1.3 攪拌速率萃取體系的攪拌程度對1-羥基芘的富集效率具有一定影響。實驗考察了300rpm、400rpm、500rpm、600rpm和700rpm的攪拌速率下纖維對1-羥基芘的萃取效率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，增大攪拌速率對1-羥基芘的富集具有先促進后抑制的趨勢。在300500r

10、pm轉(zhuǎn)速下，萃取量隨攪拌速率的增大而緩慢增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為至500rpm時，纖維對1-羥基芘的萃取量達到最大，增大轉(zhuǎn)速有利于目標(biāo)物向纖維涂層內(nèi)的轉(zhuǎn)移;當(dāng)攪拌速率繼續(xù)增大時（500700rpm），1-羥基芘萃取量逐漸降低，這與萃取體系的不穩(wěn)定性相關(guān)。因此，SPME體系的最佳攪拌速率為500rpm。2.1.4 離子強度在樣品溶液中加入氯化鈉（020%，W/V），考察離子強度對萃取效率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，鹽離子的加入可以在一定程度上促進纖維對1-羥基芘的萃取吸附，當(dāng)鹽離子濃度增大至10%時達到最佳，原因在于鹽離子可與水分子發(fā)生水合作用，使得目標(biāo)物在水中的溶解度降低，有利于向涂層內(nèi)轉(zhuǎn)移而達到較

11、高的萃取量;然而，繼續(xù)增大鹽離子濃度后，實驗發(fā)現(xiàn)1-羥基芘的萃取量反而有所降低，原因在于較多的Na+和Cl+會與目標(biāo)分析物發(fā)生競爭吸附，從而導(dǎo)致萃取量降低。因此，選擇10%的鹽離子濃度為最佳實驗條件。2.1.5 解吸時間在SPME過程結(jié)束后，將纖維頭拉回微量進樣器內(nèi)，迅速插入裝有200L甲醇的內(nèi)插管中進行溶劑解吸?？疾旖馕鼤r間（0.52.5min）對1-羥基芘富集效率的影響，結(jié)果見圖6。實驗表明，1-羥基芘的檢出量隨解吸時間的延長而緩慢增大，當(dāng)解吸時間達到2.0min之后，1-羥基芘峰面積不再增大，纖維所富集的1-羥基芘量能夠解吸完全。因此，在甲醇中的解吸時間選擇2.0min。2.2 1-羥基

12、芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及方法學(xué)評價在最優(yōu)SPME實驗條件下，利用纖維對110 000pg/mL梯度范圍內(nèi)的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進行萃取富集，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗發(fā)現(xiàn)，線性范圍為11 000pg/mL;回歸方程為Y=3.074106X+214 223，決定系數(shù)R2為0.998 7;以3倍、10倍S/N分別計算LOD為0.3 pg/mL、LOQ為1 pg/mL。為考察纖維萃取的重復(fù)性，對1天內(nèi)獨立配制的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進行5次測定，得到日內(nèi)RSD為3.6%，對連續(xù)3天獨立配制的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，得到日間RSD為5.8%，結(jié)果見圖7、表1。結(jié)果表明，本方法具有

13、較好的重復(fù)性。2.3 本SPME方法與文獻方法的比較本方法是利用自制石墨烯SPME纖維，對酶解液進行SPME富集后經(jīng)LC-FLD檢測。與文獻報道的其他1-羥基芘富集檢測方法相比，本方法具有更低的檢出限和較寬的線性范圍，具體見表2，能夠滿足痕量物質(zhì)的檢測要求。2.4 實際樣品中1-羥基芘的檢測及回收率取5名大學(xué)生晨尿，經(jīng)酶解處理使結(jié)合態(tài)1-羥基芘水解成游離態(tài)后，進行SPME-HPLC富集檢測，結(jié)果見表3、圖8。由表3可知，5名大學(xué)生尿樣中均有1-羥基芘檢出;進行加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)濃度分別為10pg/mL和100pg/mL，得到回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率為80.8%105.2%，RSD值均小于1

14、0%。實驗表明，本方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。3 結(jié) 論本章采用自制的石墨烯SPME纖維，通過石墨烯和1-羥基芘之間-作用和疏水相互作用等，建立了對1-羥基芘萃取富集的新方法。通過優(yōu)化實驗參數(shù)，得到石墨烯纖維對1-羥基芘萃取富集的最優(yōu)條件為30下以500rpm轉(zhuǎn)速萃取30min，加入氯化鈉濃度為10%（W/V），并于200L甲醇中靜態(tài)解吸2min后，通過液相色譜儀（熒光檢測器）進行定量測定。在此最優(yōu)條件下繪制了1-羥基芘富集的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3.074106 X+214 223，決定系數(shù)R2為0.998 7，線性范圍為11000 pg/mL，LOD和LOQ分別為0.3 pg/mL和1

15、 pg/mL。日內(nèi)、日間的RSD分別為3.6%和5.8%，表明石墨烯纖維的重復(fù)性較好。將本方法應(yīng)用于實際樣品檢測中，1-羥基芘檢出濃度為5.6155.63 pg/mL，加標(biāo)回收率在80.8%105.2%，RSD值均小于10%，方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。Reference1 金華麗，谷克仁.油炸食品安全性分析及危害預(yù)防J.中國油脂，2010，35（9）：74-77.2 王峰，張志杰，林慧，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測器-熒光檢測器法測定植物油中的18種多環(huán)芳烴J.食品科學(xué)， 2014，35（6）：142-145.3 段小麗，魏復(fù)盛，張軍鋒，等.多環(huán)芳烴暴露評價的生物標(biāo)志物研究J.工業(yè)衛(wèi)生

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