基于腸道菌群研究葛根芩連湯降脂并預(yù)防血糖升高的作用機(jī)制

1、 基于腸道菌群研究葛根芩連湯降脂并預(yù)防血糖升高的作用機(jī)制 姜瓔娜 曾治君 傅靈艷 盛譯萱 曾國威 姚亮亮 王瑋瑋 周子妍 徐國良 劉紅寧 摘 要 目的：研究葛根芩連湯對高脂血癥（HLP）模型大鼠血脂、血糖的影響，并從腸道菌群角度探索其作用機(jī)制。方法：將48只大鼠隨機(jī)分為空白對照組（n=8）和造模組（n=40）。造模組大鼠連續(xù)5周飼以高脂飼料以復(fù)制HLP模型，空白對照組大鼠飼以普通飼料。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組（陽性對照，10 mg/kg）和葛根芩連湯高、中、低劑量組（14.85、4.95、1.65 g/kg，以生藥量計），每組6只?？瞻讓φ战M和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽

2、水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天給藥 1次，連續(xù)給藥11周;給藥同時，各組大鼠繼續(xù)飼以相應(yīng)飼料。末次給藥后，測定大鼠體質(zhì)量、體長并計算Lees指數(shù);檢測大鼠血清中三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和空腹血糖（FBG）水平。提取大鼠盲腸內(nèi)容物DNA進(jìn)行16S rRNA V3V4區(qū)域測序，并應(yīng)用Two-part模型進(jìn)行腸道菌群與血脂、血糖的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果：給藥11周后，與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、體長、Lees指數(shù)以及血清中TC、TG、HDL-C、FBG水平均顯著增加或升高（P0.05或P0.01），HDL-C水平顯著降

3、低（P0.05）;與模型組比較，葛根芩連湯高劑量組大鼠體質(zhì)量、Lees指數(shù)和TG、FBG水平，葛根芩連湯中劑量組大鼠血清中TC、TG水平和葛根芩連湯低劑量組大鼠血清中TG水平均顯著降低（P0.05或P0.01）。與腸道菌群的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，TC和TG共享3個操作性分類單元（OTU），分別為OTU559、OTU701和OTU135（其中OTU135也與FBG共享），且均與TC、TG或FBG水平呈顯著正相關(guān)（P0.01），這3個OTU分別注釋到毛螺菌科Tyzzerella屬、疣微菌科Anaerotruncus屬和鏈球菌科Peptoclostridium屬。高、中劑量葛根芩連湯對Tyzzerella、

4、Anaerotruncus屬微生物豐度有顯著下調(diào)作用（P0.05或P0.01），但對Peptoclostridium屬微生物豐度有顯著上調(diào)作用（PKey 高脂血癥;葛根芩連湯;腸道菌群;降糖;降脂;大鼠;機(jī)制ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Gegen qinlian decoction （GGQLD） on blood lipid and blood glucose of hyperlipidemia （HLP） model rats， and to explore its mechanism from the perspective o

5、f intestinal flora. METHODS： Totally 48 rats were randomly divided into blank control group （n=8） and modeling group （n=40）. For consecutive 5 weeks， model group was given high-lipid diet to induce HLP model; blank control group was given routine diet. After modeling， 30 modeling rats were randomly

6、divided into model group， simvastatin group （positive control， 10 mg/kg）， GGQLD high-dose， medium-dose and low-dose groups （14.85， 4.95， 1.65 g/kg， by crude drug）， with 6 rats in each group. Blank control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically; administrat

7、ion groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 11 weeks. At the same time， each group was continuously given corresponding diet. After the last medication， body mass and body length of rats were determined， and Lees index was calculated. Serum levels of TG， TC，

8、 HDL-C， LDL-C and fasting blood glucose （FBG） were determined in rats. DNA of rat caecum content was extracted for 16S rRNA V3-V4 region sequencing. The Two-part model was used to analyze the correlation between intestinal flora with lipids and blood glucose. RESULTS： After 11 weeks of administratio

9、n， compared with blank control group， the body mass， body length， Lees index， serum levels of TC， TG， HDL-C and FBG of model group were increased significantly （PKEYWORDS Hyperlipidemia; Gegen qinlian decoction; Intestinal flora; Glucose-lowering; Lipid-lowering; Rats; Mechanism高脂血癥（HLP）是常見的脂質(zhì)代謝性疾病，

10、是由于血液總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平的升高和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平的降低所致1。HLP往往是糖代謝紊亂的始動因素，因此，藥物干預(yù)HLP可以預(yù)防血糖升高，進(jìn)而預(yù)防相關(guān)糖脂代謝類疾病2。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖“代謝記憶”與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)，即患者若長期處于高血糖狀態(tài)，即使后來血糖水平降低，仍易發(fā)生糖尿病相關(guān)并發(fā)癥3-4 ，故在糖尿病前期盡早治療，嚴(yán)格控制患者血糖水平，可能會降低糖尿病及其并發(fā)癥的患病風(fēng)險。葛根芩連湯出自傷寒論，由葛根、黃芩、黃連和炙甘草4味藥材組成，經(jīng)方多用于濕熱下利，現(xiàn)臨床上主要用于腸道濕熱型糖尿病、結(jié)腸炎、動脈粥樣硬化的

11、治療5。臨床試驗和藥理實驗都表明，葛根芩連湯能有效控制血糖水平6，并有較好的降血脂作用7-8。但臨床上并未見以葛根芩連湯作為降脂并且預(yù)防血糖升高的給藥用途。腸道菌群是機(jī)體復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，與宿主關(guān)系極為密切，是宿主能量代謝的重要調(diào)節(jié)因素，腸道菌群失調(diào)容易導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生肥胖、血脂異常等代謝性疾病9。研究表明，血糖、血脂也受腸道菌群調(diào)控的影響，其作用機(jī)制可能與腸道菌群參與膽酸合成和代謝、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、發(fā)酵碳水化合物最終生成短鏈脂肪酸有關(guān)10-11。基于此，本研究擬通過一種改良的相關(guān)性分析方法Two-part模型法進(jìn)行腸道菌群操作性分類單元（Operational taxonomic units

12、，OTU）水平與血糖、血脂的關(guān)聯(lián)性分析，確定對血糖、血脂有影響的重要腸道菌群的OTU，以期從OTU水平探究葛根芩連湯對HLP的治療作用以及對血糖異常升高的預(yù)防作用，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1 材料1.1 儀器BT225型電子分析天平（德國Sartorius公司）;Mo- dular P800型全自動生化分析儀（瑞士Roche公司）;Nanodrop-2000型核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ChemiDocXRS+型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;HiSeq 2500型測序平臺（美國Illumina公司）。1.2 藥品與試劑葛根飲片

13、（批號：180124，產(chǎn)地：河南）、黃芩飲片（批號：171215，產(chǎn)地：遼寧）、黃連飲片（批號：180131，產(chǎn)地：四川）、灸甘草飲片（批號：171214，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）均購自江西江中中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉勇教授鑒定依次為豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根、唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根、毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）的干燥根莖、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖;辛伐他汀片（杭州默沙東制

14、藥有限公司，批號：N025120，規(guī)格：20 mg）;總TC檢測試劑盒（批號：700487-01）、總TG檢測試劑盒（批號：627311-01）、HDL-C檢測試劑盒（批號：HL8108m）均購自瑞士Roche公司;葡萄糖檢測試劑盒（寧波普瑞柏公司，批號：GL8322）;糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：160033067）;其余試劑均為分析純，水為超純水。1.3 動物SPF級SD大鼠48只，雄性，34周齡，體質(zhì)量（9010） g，購于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-0003。動物飼養(yǎng)于該中心屏障系統(tǒng)實驗室實驗動物使用許可證號：SY

15、XK-（贛）2017-0004。本實驗已得到江西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，相關(guān)操作符合科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的實驗動物管理條例（2017版）要求。2 方法2.1 葛根芩連湯煎液的制備葛根芩連湯是由葛根、黃芩、黃連、炙甘草按8 3 3 2的質(zhì)量比組成的中藥復(fù)方。按照上述比例稱取相應(yīng)藥材適量，混勻，加8倍量水（mL/g），浸泡約30 min（以浸透為準(zhǔn)），然后加熱至沸騰，保持微沸40 min，低溫減壓濃縮，得每1 mL中含原生藥材1 g的煎液（經(jīng)高效液相色譜法檢測，該煎液中有效成分含量葛根素為23.70 mg/mL、甘草苷為4.54 mg/mL、黃連堿為10.23 mg/mL、黃芩苷為118.20 m

16、g/mL、黃連素為36.50 mg/mL、巴馬亭為6.88 mg/mL、漢黃芩苷為21.30 mg/mL、黃芩黃素為2.46 mg/mL、漢黃芩素為2.18 mg/mL、甘草酸銨為7.01 mg/mL）。將煎液封裝于消毒塑料瓶后，保存于-20 冰箱中備用。給藥前1天在4 冰箱中解凍。2.2 造模、分組與給藥將48只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組（n=8）和造模組（n=40）。空白對照組大鼠給予普通飼料（含10%脂肪、66%碳水化合物和24%蛋白質(zhì)），造模組大鼠給予高脂飼料（含60%脂肪、20%碳水化合物和20%蛋白質(zhì)），兩組大鼠均自由飲食，持續(xù)5周。在本研究中，若造模

17、大鼠體質(zhì)量超過正常體質(zhì)量的15%、Lees指數(shù)有顯著差異、血脂水平紊亂但血糖水平正常，則視為HLP模型造模成功12。以此為標(biāo)準(zhǔn)，共有30只大鼠造模成功。將這30只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組（陽性對照，10 mg/kg，相當(dāng)于臨床人用量的15倍）和葛根芩連湯高、中、低劑量組（14.85、4.95、1.65 g/kg，以生藥量計）13，每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次。在給藥同時，模型組和各藥物組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料，空白對照組大鼠繼續(xù)給予正常飼料。每2周監(jiān)測1次模型組大鼠血糖水平，當(dāng)其血清中空腹血糖（FBG）水平顯著升高時則停

18、止給藥，此時共計給藥11周。給藥期間，空白對照組大鼠由于灌胃操作意外死亡2只。3.4.3 腸道菌群OUT與FBG的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 共鑒定出43個與FBG顯著相關(guān)的OTU（28個與FBG呈正相關(guān)，15個與FBG呈負(fù)相關(guān)）。其中，有38個來自厚壁菌門（Firmicutes）：13個注釋到瘤胃菌科（Ruminococcaceae），12個注釋到毛螺菌科（Lachnospiraceae），2個注釋到肽球菌科（Peptococcaceae），3個注釋到消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae），2個注釋到丹毒科（Erysipelotrichaceae），2個注釋到克里斯滕氏菌科（Chris

19、tensenellaceae），2個注釋到梭菌目Family_ 科，余下2個分別注釋到梭菌目Clostridiaceae_1科和unclassified_o_Clostridiales科;有3個來自擬桿菌門（Bacteroidetes）：1個注釋到擬桿菌科（Bacteroidaceae），2個注釋到擬桿菌目Bacteroidales_S24-7_group科;有1個來自放線菌門（Actinobacteria）：注釋到腸桿菌科（Coriobacteriaceae）;有1個來自疣微菌門（Verrucomicrobia）：注釋到疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）。結(jié)果見圖2C。3.4

20、.4 共享OTU的豐度分析結(jié)果 TC、TG共享的OTU有3個（OTU559、OTU701和OTU135），都顯示出強(qiáng)的正相關(guān)性，分別注釋到毛螺菌科Tyzzerella屬、疣微菌科Anaerotruncus屬和肽鏈球菌科Peptoclostridium屬，其中OTU135也與FBG呈強(qiáng)的正相關(guān)性。給藥前，與空白對照組比較，其余各組大鼠盲腸內(nèi)容物中OTU559、OTU701、OTU135豐度值均顯著升高（P0.01）。給藥11周后，與空白對照組比較，模型組大鼠盲腸內(nèi)容物中OTU559、OTU701、OTU135豐度值仍顯著升高（P0.01）;與模型組比較，葛根芩連湯高、中劑量組大鼠盲腸內(nèi)容物中OT

21、U559、OTU701豐度值均顯著降低（P0.05或P0.01），但葛根芩連湯各劑量組大鼠盲腸內(nèi)容物中OTU135豐度值均顯著升高（P0.05或P0.01）。各組大鼠盲腸內(nèi)容物中OTU559、OTU701、OTU135豐度值測定結(jié)果見表3。4 討論糖代謝紊亂前期往往伴隨脂代謝的紊亂，他汀類藥物是治療HLP的首選藥物，在臨床應(yīng)用廣泛16，故本研究選擇辛伐他汀作為陽性藥物。然而，近期一些臨床數(shù)據(jù)顯示，長期服用他汀類藥物會增加胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)生的風(fēng)險17，故尋求安全、有效、副作用小的中藥復(fù)方來治療HLP并同時預(yù)防血糖升高，對于糖尿病前期臨床給藥具有重要意義。HLP主要表現(xiàn)為TC、TG、LDL

22、-C等血脂水平異常升高，并且當(dāng)血糖水平升高時會加劇血脂水平的異常18。在本研究中，本課題組在成功建立大鼠HLP模型后，為了探討葛根芩連湯在降脂的同時是否具有預(yù)防血糖異常升高的作用，每2周檢測1次血脂、血糖的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給藥11周時，與空白對照組比較，模型組大鼠不僅血脂水平保持了顯著升高，同時血糖水平也開始顯著升高;而葛根芩連湯藥物組血脂水平顯著降低，并且血糖水平顯著下調(diào)，因此本課題組將此視為給藥終點(diǎn)，并停止給藥。本研究結(jié)果顯示，高劑量葛根芩連湯可顯著降低HLP模型大鼠體質(zhì)量，中劑量葛根芩連湯可顯著降低其血清中TC水平，高、中、低劑量葛根芩連湯均可顯著降低其血清中TG水平，這說明葛根芩連湯

23、具有調(diào)節(jié)HLP大鼠血脂紊亂的作用。此外，陽性對照藥辛伐他汀對于TC、LDL-C等指標(biāo)的降低作用不明顯，這可能與懸浮液灌胃給藥或者應(yīng)用的高脂飼料影響了其吸收等原因有關(guān)，具體原因尚不清楚。但從本研究結(jié)果來看，葛根芩連湯降脂作用優(yōu)于辛伐他汀。但葛根芩連湯對于HDL-C、LDL-C的作用效果不明顯。給藥11周后，與空白對照組比較，模型組大鼠FBG水平顯著升高，而葛根芩連湯高劑量組大鼠FBG水平顯著降低，這表明葛根芩連湯對糖代謝紊亂確實有一定的預(yù)防作用。腸道微生物可能通過參與宿主代謝的方式參與血糖、血脂調(diào)節(jié)。本研究采用Two-part模型篩選與血脂、血糖顯著相關(guān)的OTU，該模型可以解釋二元（即檢測到/未

24、檢測到）和定量特征，這種方法克服了OTU的豐度分布明顯偏離正態(tài)分布的特征。通過該模型的分析，可以檢測到微生物（以O(shè)TU表示）的存在與否，以及其豐度高低對表型指標(biāo)的影響。本研究共發(fā)現(xiàn)3個對TC、TG均有顯著影響的OTU（OTU559、OTU701和OTU135），并且OTU135也對FBG也有顯著影響。其中，OTU701注釋到疣微菌科Anaerotruncus屬，該屬微生物可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸與能量代謝、糖脂代謝有密切關(guān)系19，例如Song X等20研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠糞便中富集了Anaerotruncus。OTU559注釋到毛螺菌科Tyzzerella屬，該屬微生物易受飲食影響21，

25、例如Kelly TN等22研究發(fā)現(xiàn)，糞便中富集了Tyzzerella的群體患心血管疾病的風(fēng)險增高，這表明Tyzzerella含量升高時血糖、血脂可能隨之升高。OTU135注釋到鏈球菌科Peptoclostridium屬，該屬微生物是一種人畜共患病原體，也是導(dǎo)致腹瀉和結(jié)腸炎的重要病原體23-24，為條件致病菌。本研究結(jié)果顯示，高、中劑量葛根芩連湯給藥11周后，可顯著下調(diào)大鼠盲腸內(nèi)容物中與血脂（TC、TG）呈正相關(guān)的腸道菌群OTU559、OTU701的豐度。但葛根芩連湯各劑量組大鼠盲腸內(nèi)容物中OTU135豐度較模型組均顯著升高，這可能是因為葛根芩連湯中黃芩和黃連皆為苦寒藥，長期給藥后易損傷脾胃，造

26、成脾虛后導(dǎo)致腹瀉，進(jìn)而造成Peptoclostridium屬微生物含量升高。綜上所述，高劑量（14.85 g/kg）葛根芩連湯可降低HLP模型大鼠的體質(zhì)量和血脂水平，并可預(yù)防其血糖異常升高，其中以葛根芩連湯高劑量的作用最明顯;其作用機(jī)制可能與降低腸道菌（Tyzzerella、Anaerotruncus屬）的含量有關(guān)。本研究結(jié)果為葛根芩連湯應(yīng)用于臨床降脂和預(yù)防血糖升高提供了一定的實驗基礎(chǔ)。但對于陽性對照藥的給藥方式和劑量應(yīng)該加以優(yōu)化，并需擴(kuò)大動物樣本量。后續(xù)工作中擬對關(guān)聯(lián)性分析所確定的重要OTU進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，然后移植無菌小鼠進(jìn)行驗證，以進(jìn)一步確定目標(biāo)菌是否具有影響血脂和血糖的功能。Refer

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