HPLC色譜分析中常見問題課件

1、HPLC色譜分析中常見問題與解決方法姚彤煒 主講浙江大學(xué)藥學(xué)院第1頁，共14頁。色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因進口濾片堵塞吸附了樣品雜質(zhì)柱填充不良，使用久，機械及熱沖擊造成空洞固定相遭化學(xué)侵蝕2022/8/182第2頁，共14頁。柱凹陷出現(xiàn)裂峰現(xiàn)象，填料與色譜柱頂端不齊平，可用相同填料填平凹陷處壓力影響應(yīng)避免突然的壓力波動與任何的機械與熱力沖擊，如：色譜柱掉在實驗臺上驟然改變柱溫進樣過程中轉(zhuǎn)動進樣閥太慢引起壓力波動，使色譜峰產(chǎn)生裂隙2022/8/183第3頁，共14頁。柱壓升高原因強保留樣品組分強吸附組分易聚集在柱

2、進口填料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分、緩控釋制劑中的高分子輔料等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時往往是強保留污染物在柱口處聚集的信號解決辦法使用保護柱可延長分析柱壽命每天實驗后應(yīng)用強溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱并定期進行保養(yǎng)，以低流速的強溶劑較長時間沖洗色譜柱2022/8/184第4頁，共14頁。樣品純度差有微小的顆粒堵塞管路可用濾膜過濾樣品后再進樣樣品濃度高連續(xù)進樣，造成過載如果樣品吸收度不是太低，使樣品濃度在0.5mg/ml以下較適宜 流動相中緩沖液濃度過高,有機相比例大在色譜過程中堵塞管路，析出的鹽結(jié)晶還磨損泵、進樣閥密封圈造成漏液緩沖液濃度一

3、般控制在20mmol以下較適宜，測定完畢后必須及時沖洗2022/8/185第5頁，共14頁。注意！ 一旦柱壓升高，應(yīng)停止測定，用水沖洗數(shù)小時或更長時間，待壓力下降后再測定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級檢查，換泵頭上濾芯，保護柱等2022/8/186第6頁，共14頁。檢測器泵分析柱預(yù)柱流路檢查順序進樣閥2022/8/187第7頁，共14頁。柱效低的原因頻繁更換流動相組成加速柱效降低最好一根色譜柱使用的流動相成分和pH值相近，如始終在酸性條件下或堿性條件下工作 色譜柱的選擇不合適或使用時間久更換色譜柱（廠家，型號）進樣操作不當(dāng)轉(zhuǎn)動進樣閥時應(yīng)一次轉(zhuǎn)到位，不能過慢或停頓，否則易造成裂峰 2022/8

4、/188第8頁，共14頁。樣品溶劑與流動相成分不匹配樣品溶劑與流動相成分不匹配，造成前沿峰，倒峰或裂峰如樣品用純甲醇作溶劑，而流動相中甲醇比例很低，這樣易出現(xiàn)前沿峰，改變樣品溶劑成分或比例，使醇-水比例接近于流動相前沿峰倒峰裂峰柱凹陷？2022/8/189第9頁，共14頁。結(jié)果不能重現(xiàn) 表現(xiàn)為同一樣品溶液連續(xù)進樣所得峰面積相差大，引起這種情況時，可從以下幾方面來查找原因：泵、進樣閥、管路漏液：造成峰面積變化儀器未達平衡：穩(wěn)定時間不夠進樣量太少：注射體積剛夠定量圈體積檢測器靈敏度改變：如果同一樣品兩次進樣峰面積相差10倍或更大倍數(shù)，則最可能的原因是檢測器的靈敏度被無意中改變，軟件的靈敏度改變不會

5、影響峰面積的積分?jǐn)?shù)值2022/8/1810第10頁，共14頁。色譜軟件積分方式是否一致尤其是對于色譜峰較復(fù)雜的，積分時基線稍有變化將造成峰面積大的變化，如果兩峰不是基線分離，則峰切割方式對峰面積有很大影響，有時候采用峰高較峰面積誤差小垂直切割基線切割2022/8/1811第11頁，共14頁。進樣量對色譜峰分離影響例：三七提取物以甲醇為溶劑，流動相：乙腈-水,梯度洗脫，乙腈初始濃度20% 進樣量50L 進樣量10L 正常異常2022/8/1812第12頁，共14頁。主動閥故障對色譜分離影響主動閥閥芯出問題時，壓力線會有不正常的壓力降，或者是壓力線波動很大，超過正負23個bar導(dǎo)致進樣后，各組分出峰忽而正常，忽而異常，且峰位置發(fā)生明顯變化更換主動閥閥芯，可消除上述癥狀 202