微生物代謝工程

1、微生物代謝工程代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使得目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵。代謝控制發(fā)酵的核心：解除微生物代謝控制機制，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。微生物代謝工程定義、研究內(nèi)容和研究手段定義：應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進行有精確目標的遺傳操作，改變酶的功能或輸送體系的功能，甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能，以改進細胞某些方面的代謝活性的整套操作工作(包括代謝分析、代謝設(shè)計、遺傳操作、目的代謝活性的實現(xiàn))。簡而言之，代謝工程是生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾。研究內(nèi)容：代謝流的定量和

2、定向細胞對底物的吸收和產(chǎn)品的釋放模型及分析研究胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法用13C標記實驗進行胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析研究手段采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作基因工程技術(shù)的應(yīng)用。常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用。生物合成途徑的代謝調(diào)控生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測定。共合成法在生物合成中的應(yīng)用。酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏。無機磷對生物合成的調(diào)節(jié)。研究生物合成機制的常用方法刺激實驗法。同位素示蹤法。洗滌菌絲懸浮法。無細胞抽提法。遺傳特性誘變法。工業(yè)發(fā)酵的五字策略(圖示加文字說明)進，在育種和發(fā)酵控制方面都要促進細胞對碳源營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；通，在育種方面解除對某些酶的反饋調(diào)節(jié)，在發(fā)酵控制方面，誘導(dǎo)這些酶的合成或激活這些酶，從而使

3、來自各代謝物流(除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流)能夠暢通的注入載流途徑，匯入代謝主流，流向目的產(chǎn)物，特別是當發(fā)酵進入目的產(chǎn)物合成階段后，必需確保載流路徑通暢，代謝主流優(yōu)勢明顯節(jié)，采用育種或發(fā)酵控制手段，節(jié)制與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物。這里所謂的“節(jié)制”是指封閉或削弱以目的產(chǎn)物合成途徑的起始底物或以中間產(chǎn)物為起始底物的分支途徑；堵，采用育種或發(fā)酵手段消除或削弱目的產(chǎn)物進一步代謝的途徑，包括目的產(chǎn)物參與的分解代謝和合成代謝，為了消除或削弱目的產(chǎn)物的進一步分解代謝，就必須降解目的產(chǎn)物進一步代謝的酶活力或酶量，甚至使這些酶不再合成或不起作用；出

4、，促進目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。在育種和發(fā)酵控制發(fā)面可通過調(diào)節(jié)細胞對目的產(chǎn)物的通透性，增加輸送目的產(chǎn)物的載體蛋白的量，為目的產(chǎn)物輸送代謝能的方法，使目的產(chǎn)物盡快轉(zhuǎn)移出細胞。酶的阻遏機制，以大腸桿菌色氨酸或組氨酸操縱子為例來說明(圖示加文字說明)終端產(chǎn)物對其自身合成途徑的酶的合成的反饋阻遏和弱化的機制反饋阻遏：WSiS2S3rF魅謚R1皿窯肇前工一LO岸于空物合愈的S8組氨酸操縱子：與His降解代謝有關(guān)的兩組酶類被稱為hut酶，控制這些酶合成的操縱子被稱為hutoperon。由一個多重調(diào)節(jié)的操縱子控制，有兩個啟動子，兩個操縱區(qū)及兩個正調(diào)節(jié)蛋白。Hut操縱子共編碼4種酶和一個阻遏物。4種酶分別由hu

5、tG，hutH，hutl及hutU基因編碼，阻遏物則由hutC基因編碼。在產(chǎn)氣克氏菌中，以上基因構(gòu)成兩個轉(zhuǎn)錄單位，hutl，hutG和hutU，hutH分別被轉(zhuǎn)錄合成兩條mRNA長鏈。這兩個轉(zhuǎn)錄單位各自都有一個啟動子和一個操縱區(qū)，其轉(zhuǎn)錄過程都是從左向右進行的，hutC阻遏物能與每個操縱區(qū)相結(jié)合。無論以組氨酸作為唯一碳源或氮源，hut操縱子都會處于有活性狀態(tài)。Hut操縱子的每一個啟動子上都有cAMP-CAP結(jié)合位點，當碳供應(yīng)匱乏時，能合成cAMP，出現(xiàn)cAMP-CAP復(fù)合物，并與操縱區(qū)上的相應(yīng)位點結(jié)合，誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄。協(xié)同反饋抑制，以谷氨酸產(chǎn)生菌（棒桿菌或短桿菌）天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中反饋調(diào)節(jié)

6、為例來說明（圖示加文字說明）終產(chǎn)物的協(xié)同庭詡了抑制扎，犠武性1m鬟?artfe樺狀桿苗中孟門舞滅總族楓甚癮的合咸途徑和調(diào)節(jié)憤況tt臺咸;諭徑祥細踴中址ira用的上圖為谷氨酸棒桿菌中天門冬氨酸族氨基酸合成過程中的終產(chǎn)物的協(xié)同（反饋）抑制機理。協(xié)同反饋抑制是指在分支代謝途徑中，幾種末端產(chǎn)物同時都過量，才對途徑中的第一個酶具有抑制作用，若某一末端產(chǎn)物單獨過量則對途徑中的第一個酶無抑制作用的現(xiàn)象。天門冬氨酸族氨基酸合成起始于天冬氨酸，經(jīng)過兩個分支最終合成終產(chǎn)物賴氨酸、蘇氨酸以及甲硫氨酸，而終產(chǎn)物中賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同起來對該途徑第一步中的酶天門冬氨酸激酶具有抑制作用，這既為天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中協(xié)同

7、反饋抑制。營養(yǎng)缺陷型和結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株（以賴氨酸產(chǎn)生菌為例）如何選育獲得（1）營養(yǎng)缺陷型突變株的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變株。營養(yǎng)缺陷型的篩選與鑒定涉及下列幾種培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM）是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）是指可滿足某種微生物的一切營養(yǎng)缺陷型菌株的營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM）是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長需求的合成或半合成培養(yǎng)基。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般要經(jīng)過以下四個環(huán)節(jié)。第一步，誘變劑處

8、理。第二步，淘汰野生型：在誘變后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般較低。通過以下的抗生素法或菌絲過濾法就可淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株即濃縮了營養(yǎng)缺陷型。第三步，檢出缺陷型：具體方法很多。用一個培養(yǎng)皿即可檢出的，有夾層培養(yǎng)法和限量補充培養(yǎng)法；在不同培養(yǎng)皿上分別進行對照和檢出的，有逐個檢出法和影印接種法?？筛鶕?jù)實驗要求和實驗室具體條件加以選用。第四步，鑒定缺陷型：可借生長譜法進行。生長譜法是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。(2)結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株的選育過程確定結(jié)構(gòu)類似物進行生長抑制試驗和敏感性試驗設(shè)計“篩子”a根據(jù)反饋

9、調(diào)節(jié)機制設(shè)計b.同時要考慮協(xié)同調(diào)節(jié)機制等c.要考慮實驗的成本問題d.根據(jù)問題多的輕重緩急設(shè)計確定結(jié)構(gòu)類似物劑量確定篩選的具體方法a.濃度梯度平板篩選法b.紙片法c.液體培養(yǎng)濃縮后涂布的方法高產(chǎn)株的檢出a.反饋調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)突變株：抗性b.輸送體系突變株：抗性c.影響與底物的親和能力的突變株：超敏性d.對入圍的突變株進行產(chǎn)量形狀的篩選以初級代謝產(chǎn)物乙醇(利用包括葡萄糖等各種原料)或1，3丙二醇為例，簡述微生物代謝設(shè)計育種方案答：以代謝產(chǎn)物為乙醇為例代謝育種方案的設(shè)計許多細菌、真菌和高等植物中都存在由丙酮酸生成乙醇的途徑，它為厭氧條件下的糖酵解途徑起著再生NAD+的重要作用。其中，丙酮酸脫羧酶(PDC

10、)催化丙酮酸的非氧化脫羧反應(yīng)，形成二氧化碳和乙醛；后者在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖肌Ｓ捎诒嵩谔墙徒馔緩街惺莻€關(guān)鍵的節(jié)點，與草酰乙酸、乙酰輔酶A、乳酸等合成途徑均有密切聯(lián)系，因此可以采用工業(yè)發(fā)酵的五字策略，通過強化表達細胞內(nèi)PDC和ADH的活性來擴增目標途徑，阻斷副產(chǎn)物的形成路線，解除乙醇生物合成的代謝阻遏作用來提高菌株乙醇產(chǎn)量。代謝育種方案的實施菌種選定使用嗜溫或嗜熱性的梭菌屬由纖維素類物質(zhì)直接厭氧發(fā)酵乙醇，是生物能源再生的一種理想選擇，其優(yōu)點為代謝速率快，最終產(chǎn)物回收率高，細胞和酶系穩(wěn)定，并能直接轉(zhuǎn)化纖維素或戊糖。遺傳操作方案的制定這類細菌用于工業(yè)規(guī)模的乙醇發(fā)酵也存在兩大缺陷

11、：在乙醇發(fā)酵過程中往往伴有乙酸和丁酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，而且最終產(chǎn)物的最高積累濃度僅為3左右，由此則采用分子生物學(xué)方法對菌株進行改進以提高乙醇產(chǎn)量。遺傳操作方案的實施利用DNA重組技術(shù)重新設(shè)計糖酵解途徑，阻斷副產(chǎn)物的形成路線，解除乙醇生物合成的代謝阻遏作用，同時提高細胞對高濃度乙醇的耐受性，是高產(chǎn)乙醇梭菌屬工程菌構(gòu)建的主要內(nèi)容。變異株培養(yǎng)條件的優(yōu)化對變異株培養(yǎng)條件的進行優(yōu)化，優(yōu)化時盡量從生物學(xué)的角度安排試驗，盡量排除培養(yǎng)基消毒、搖瓶培養(yǎng)條件不一致帶來的系統(tǒng)誤差，每批搖瓶試驗都要做對照，注重產(chǎn)量與菌體量之間的的微妙關(guān)系。如何采用代謝工程進行氨基酸(如賴氨酸或蘇氨酸)育種？答：以蘇氨酸產(chǎn)生菌育種為例代

12、謝育種方案的設(shè)計中心代謝流上節(jié)點的分析：在谷氨酸棒桿菌中，存在著由L-天門冬氨酸為起點產(chǎn)生L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑，整個途徑含有兩大節(jié)點：即由L-丁氨醛酸合成L-賴氨酸或高絲氨酸，以及由高絲氨酸合成L-蛋氨酸或L-蘇氨酸直至L-異亮氨酸。前一節(jié)點兩條途徑的代謝流選擇由高絲氨酸脫氫酶(HD)和二氫吡啶羧酸合成酶對其共同底物丁氨醛酸的相對親和性控制，這兩個酶的編碼基因分別為hom和dapA。在正常情況下，HD的底物親和性以及轉(zhuǎn)化率是其競爭對手二氫吡啶羧酸合成酶的25倍，因此碳源主要流向蘇氨酸-蛋氨酸生物合成途徑。但當產(chǎn)生菌細胞內(nèi)蘇氨酸大量積累時，由于HD對L-蘇氨酸的變構(gòu)抑制作用極為

13、敏感，導(dǎo)致丁氨醛酸優(yōu)先進入賴氨酸生物合成途徑。理想載流途徑的推定：谷氨酸棒桿菌的HD和高絲氨酸激酶(HK)由hom-thrB操縱子編碼，在hom編碼序列上游鄰近區(qū)域存在一個單一的啟動子，L-蛋氨酸的阻遏作用可使這個啟動子介導(dǎo)的操縱子轉(zhuǎn)錄水平降低3倍。此外，在操縱子mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點與翻譯起始密碼子之間還存在著一個衰減子結(jié)構(gòu)。為此根據(jù)L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑，采用工業(yè)發(fā)酵的五字策略，主要通過阻塞與目的產(chǎn)物L-蘇氨酸的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物，以及消除或削弱目的產(chǎn)物進一步代謝的途徑的方法提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。代謝育種方案的實施菌種選定谷氨酸棒

14、狀桿菌，優(yōu)點：工業(yè)中以廣泛應(yīng)用的菌株。遺傳操作方案的制定與實施提高野生型hom基因編碼產(chǎn)物HD的表達水平，緩和由于蘇氨酸變構(gòu)抑制作用而導(dǎo)致的酶活降低程度，或者直接用homdr突變基因代替生產(chǎn)菌中的野生型hom基因。在homdr出突變株中，同時克隆表達thrB和thrC基因，但轉(zhuǎn)化子在蘇氨酸的合成能力上并沒有新的突破。克隆表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。該酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物為草酰乙酸，它是L-天冬氨酸生物合成的前體，因此草酰乙酸的大量積累有助于L-天冬氨酸類氨基酸合成產(chǎn)率的提高。蘇氨酸合成的顯著流分被轉(zhuǎn)化成異亮氨酸或者進一步降解為甘氨酸。蘇氨酸向異亮氨酸的轉(zhuǎn)化可通過同源交換構(gòu)建ilvA突變株而抑制

15、，而阻斷蘇氨酸到甘氨酸的降解途徑則是個具有挑戰(zhàn)性的難題，涉及到多個途徑，而且有關(guān)的基因在棒狀桿菌中尚未被鑒定。變異株培養(yǎng)條件的優(yōu)化對變異株培養(yǎng)條件的進行優(yōu)化，優(yōu)化時盡量從生物學(xué)的角度安排試驗，盡量排除培養(yǎng)基消毒、搖瓶培養(yǎng)條件不一致帶來的系統(tǒng)誤差，每批搖瓶試驗都要做對照，注重產(chǎn)量與菌體量之間的的微妙關(guān)系。氨基酸生物合成的代謝流量分析涉及到哪幾方面的內(nèi)容？除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機制和已知途徑的化學(xué)計量分析以外，穩(wěn)態(tài)代謝流量和流量動力學(xué)分析對于理解氨基酸生產(chǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)也越來越重要。這涉及到提供碳架物質(zhì)、氧化還原當量和代謝能的中心代謝途徑,也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代謝途徑。代謝流量分析和代謝流的

16、動力學(xué)分析的一個主要目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認為的限速步驟。由于我國人多地少，在不爭或少爭口糧的前提下，如何建成12個綠色大慶？利用生物質(zhì)能源生產(chǎn)乙醇作為燃料木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的來源卻極其豐富且廉價，由于它不能被人體消化，因此不能用做食品工業(yè)的原料，也很難被轉(zhuǎn)化為發(fā)酵用的葡萄糖。木質(zhì)纖維素類物質(zhì)之所以被認為是乙醇燃料生產(chǎn)的合適原材料，其原因還在于它可由生長期較短的木材、農(nóng)業(yè)和林業(yè)的廢料（如作物秸稈和樹枝樹葉），以及各類廢棄物（如腐爛物、廢紙和市政固體垃圾）獲得。Zvmonitjftasttitibilix殛構(gòu)化_岌酵木搪異構(gòu)酶Suxh雖亦彈口spp.To.列珂山訕尿?qū)蟟s紐mm界?我國可以用

17、于生物質(zhì)能源生產(chǎn)的植物和原料很多，如糖質(zhì)原料（甘蔗、甜菜等）、淀粉（玉米、小麥、薯類等），目前已用于燃料乙醇的生產(chǎn)，以這些原料生產(chǎn)的燃料乙醇能力已達300萬噸左右。充分利用現(xiàn)有土地與技術(shù)，生產(chǎn)的生物質(zhì)可轉(zhuǎn)化5000萬噸酒精，接近兩個大慶的能源當量。燃料乙醇原料生產(chǎn)既可使用玉米、小麥、薯類、秸稈等現(xiàn)成的農(nóng)產(chǎn)品，又可專門種植一些原料。利用發(fā)酵法利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的菌株可通過以下方法獲得酵母菌屬乙醇發(fā)酵途徑的改良利用基因重組工程技術(shù)改良酵母菌屬乙醇發(fā)酵過程使酵母菌能夠有效地將木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，而且這些克隆的木糖代謝基因的表達不再需要木糖誘導(dǎo)，也不為葡萄糖所阻遏。運動發(fā)酵單胞菌中戊糖代謝途徑的引入*抑制tJILjW將乙醇合成基因引入腸道細菌，同時在天然乙醇生產(chǎn)菌株（如釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌）中引入來自其他微生物種屬的戊糖代謝途徑，這是構(gòu)建理想的乙醇生產(chǎn)菌的主要內(nèi)容。梭菌屬生產(chǎn)乙醇的可行性分析使用嗜溫或嗜熱性的梭菌屬由纖維素類物質(zhì)直接厭氧發(fā)酵乙醇，是生物能源再生的一種理想選擇，其優(yōu)點為代謝速率快，最終產(chǎn)物回收率高，細胞和酶系穩(wěn)定，并能直接轉(zhuǎn)化纖維素或