銅藍(lán)蛋白生理功能及其和疾病的關(guān)系

1、銅藍(lán)蛋白生理功能及其和疾病的關(guān)系 1 銅藍(lán)蛋白的研究概況 銅藍(lán)蛋白( EC 1. 16. 3. ) 又稱銅氧化酶,是Holmberg 和 Laurell 于 1948 年首先從人血清 a2 -球蛋白中純化出的一種外觀呈藍(lán)色的:請記住我站域名/ 2 銅藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu) 人的 Cp 基因位于 8 號染色體,基因定位3q23 - q25,基因長度為 65 kb,包含 19 個外顯子。 人的 Cp 蛋白是一條單一的多肽鏈,由1046 個氨基酸和附著在上面的 4 個寡糖一氨基葡萄糖組成,相對分子質(zhì)量約為 132 kDa4. 二級結(jié)構(gòu)測定表明,Cp 肽鏈中的 - 片層和無規(guī)卷曲約各占50% ,幾乎沒有 - 螺

2、旋結(jié)構(gòu)。 單一的多肽鏈可被蛋白酶水解為 3 組異體同形的單元,相對分子量分別為 67 KD ( 480 個氨基酸殘基) 、50 KD( 405 個氨基酸殘基) 及 19 KD ( 159 個氨基酸殘基) ,在完整的多肽鏈中,3 個單元分別由單個氨基酸殘基精氨酸 R、賴氨酸 K 連接5. Cp 有 6 個緊湊的結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合 6 個銅原子,位于一、六域交界面上的 3 個銅原子形成一個三核銅簇,其他3 個銅原子以單核形式分別存在于二、四、六域( 圖1) . 三核銅簇不僅對于 Cp 的催化活性有著重要作用,而且有助于 Cp 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定4. 3 銅藍(lán)蛋白的組織合成與分布 脊椎動物 Cp 主要是由肝臟合

3、成的,其他如大腦、胎盤、卵黃囊、乳腺及睪丸的支持細(xì)胞也可獨(dú)立合成 Cp. 在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中首先合成前銅藍(lán)蛋白( apo-cemloplasmin) ,進(jìn)而在高爾基體中與Cu 結(jié)合形成全銅藍(lán)蛋白( holo-cemloplasmin) ,隨后 Cp 從肝臟經(jīng)膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)并由其他組織器官攝取6. 正常生理?xiàng)l件下,肝銅儲備的增加可引起 Cp濃度持續(xù)性的增加,當(dāng)銅儲備量缺乏時(shí)會引起 Cp濃度的顯著降低。 腦內(nèi)合成的 Cp 主要為磷酸肌醇錨定形式( glycosylph-osphatidyIinositolanchored Cp,GPI - Cp) ,結(jié)合在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上7. 研究發(fā)現(xiàn)雌激素可增加 Cp

4、 的合成,懷孕期動物雌激素濃度升高時(shí),Cp 的濃度可增加 3 4 倍8.銅藍(lán)蛋白主要在分布于血清當(dāng)中,上述合成部位也有一定分布,在不同物種中這種分布可能會有差異。 4 銅藍(lán)蛋白的生理功能 4. 1 銅藍(lán)蛋白具有氧化酶功能 銅藍(lán)蛋白本身屬于多銅氧化酶家族,具有氧化酶的功能,可在其單銅離子中心接受底物電子,并將之轉(zhuǎn)移到多銅離子中心,以便分子氧結(jié)合并將其還原成水9. 在此過程中,金屬離子如銅和鐵離子都可以作為其底物,銅藍(lán)蛋白可以將 Fe2 +和 Cu1 +分別氧化為 Fe3 +和 Cu2 +10,從而使其在體內(nèi)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝( 圖 2) . 在體內(nèi),銅藍(lán)蛋白的胺氧化酶作用可將分子氧氧化生成水或者

5、過氧化氫,對機(jī)體內(nèi)的其他有機(jī)底物如苯二胺有胺氧化酶作用11,對鄰苯二酚及其類似物如多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、5 - 羥色胺及色氨酸等具有鄰苯二酚氧化酶的作用。 4. 2銅藍(lán)蛋白調(diào)節(jié)銅的代謝 銅是機(jī)體必需的微量元素,Cp 在銅的代謝過程中發(fā)揮重要的作用。 銅在十二指腸被吸收后,由銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)蛋白( 銅藍(lán)蛋白、白蛋白、銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、某些銅復(fù)合物及組氨酸等低分子量蛋白)轉(zhuǎn)運(yùn)到腸上皮細(xì)胞,經(jīng)過血液循環(huán)迅速進(jìn)入肝、腎中。 銅的分子伴侶 ATOX1 ( ATPases-ATP7A andB) 將銅原子傳遞給肝腎細(xì)胞合成的 Cp13. 結(jié)合銅的 Cp 是血清中銅的主要載體,當(dāng)銅藍(lán)蛋白到達(dá)靶細(xì)胞表面時(shí),

6、會與其相應(yīng)的受體相互作用釋放銅,這些銅被靶細(xì)胞吸收和利用。 通過銅藍(lán)蛋白對銅離子的結(jié)合和釋放,實(shí)現(xiàn)了銅在機(jī)體內(nèi)的分布。 除此以外,銅對機(jī)體 Cp 的合成和代謝也有調(diào)節(jié)作用,例如,加銅螯合劑培養(yǎng)的 C6 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞阻礙了 GPI - Cp 的表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞中 Cp 的減少,說明銅能調(diào)節(jié) Cp 的合成。 Gitlin D 等發(fā)現(xiàn) Cp的半衰期為 5. 5 d14,機(jī)體內(nèi)未結(jié)合銅的 apo -Cp 其半衰期為 5 小時(shí)7,表明銅能調(diào)控 Cp 的代謝。 更進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn),無銅結(jié)合的 Cp 是一種變構(gòu)蛋白,與銅結(jié)合時(shí)會導(dǎo)致其沉降率及電泳動度特性發(fā)生改變,但二級結(jié)構(gòu)不變; 這種變構(gòu)活性不僅可以使其從肝

7、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放,而且還可使其不受到膽汁所造成的酸性環(huán)境的破壞,在后續(xù)過程中,該結(jié)構(gòu)仍可與銅相結(jié)合,說明脫銅銅藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)也會影響銅的代謝15. 4. 3 銅藍(lán)蛋白參與鐵的代謝 Cp - 轉(zhuǎn)鐵蛋白系統(tǒng)( ceruloplasmin-ferroportinsystem,Cp - Fpn ) 是細(xì)胞內(nèi)鐵的主要輸出途徑16. 鐵在體內(nèi)的跨膜運(yùn)輸需要特定的蛋白質(zhì)載體即鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( Ferroportin,Fpn) . 雖然有許多蛋白參與細(xì)胞鐵的吸收,但目前被確認(rèn)的細(xì)胞鐵輸出系統(tǒng)只有 Cp - Fpn 系統(tǒng)。 哺乳動物體內(nèi)由小腸吸收 Fe2 +,然后以 Fe3 +的形式貯藏; 之后 Fe3 +再次被鐵釋

8、放蛋白還原為 Fe2 +進(jìn)入血液循環(huán); 血漿中的 Cp 利用其亞鐵氧化酶活性將 Fe2 +氧化成能與 Fpn 結(jié)合的 Fe3 +,Fe3 +結(jié)合 Fpn 后被轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞,經(jīng)內(nèi)吞后進(jìn)行代謝或貯存。 研究表明,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的以 GPI 錨定形式的 Cp 能促進(jìn)鐵從神經(jīng)細(xì)胞中輸出。 而在 Cp 基因缺失的小鼠,在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中鐵輸出過程發(fā)生障礙,中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)鐵的沉積。 另外,具有Cp 缺陷基因和患有遺傳性 Cp 缺乏癥的個體銅水平正常,但鐵代謝嚴(yán)重失調(diào)17 -18. 這些都說明 Cp在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過程中不可或缺的作用。 4. 4 銅藍(lán)蛋白具有抗氧化作用 Cp 是一種重要的抗氧化劑,可

9、以抑制由亞鐵離子介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧; 同時(shí),Cp 還可以進(jìn)一步利用抗氧化作用,減少體內(nèi)金屬毒性,避免組織損傷及機(jī)體功能障礙。 有研究發(fā)現(xiàn),Cp 能抑制黃嘌呤氧化酶,具有類似于超氧化物歧化酶對陰離子自由基的清除功能; Cp 不僅能與血液及組織液中Cu2 +結(jié)合,具有顯著抑制 Cu2 +誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用,而且還可有效拮抗 Cu2 +誘發(fā)的紅細(xì)胞水解19. 當(dāng)氧化應(yīng)激毒物三硝基甲苯( TNT) 進(jìn)入小鼠體內(nèi),經(jīng)還原產(chǎn)生的 O2 -可由超氧化物歧化酶作用生成 H2O2,一般情況下 H2O2可與 Fe2 +發(fā)生Fenton 反 應(yīng) ( Fe2 + H2O2 Fe3 + OH-+OH+) ,但當(dāng) Cp

10、存在時(shí)可通過其鐵氧化酶活性競爭利用上述反應(yīng)環(huán)境中的 Fe2 +并將其氧化為Fe3 +,于是 Fenton 反應(yīng)被消除,抗氧化作用得以實(shí)現(xiàn)20. 此外,Cp 在體內(nèi)還可誘導(dǎo)一氧化氮合成酶的表達(dá),促進(jìn)機(jī)體 NO 的合成,通過 NO 清除自由基的途徑而間接發(fā)揮抗氧化的作用21. 5 銅藍(lán)蛋白與疾病 5. 1 銅藍(lán)蛋白與遺傳性銅藍(lán)蛋白缺乏癥 遺傳性銅藍(lán)蛋白缺乏癥( aceruloplasminemia)是一種罕見的常染色體上 Cp 基因的突變引起的疾病23. Cp 基因的錯義突變使 Cp 的亞鐵氧化酶的活性喪失,致使 Fe2 +無法氧化成 Fe3 +,進(jìn)而不能與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( Fpn) 結(jié)合進(jìn)行鐵的輸出

11、17. 同時(shí),也會引起神經(jīng)系統(tǒng)中 Fe2 +大量沉積和 Fe3 +缺乏,從而造成神經(jīng)細(xì)胞因營養(yǎng)缺乏和自由基累積,導(dǎo)致組織損傷以致最終引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性17. 盡管 Cp 因錯義突變會導(dǎo)致其銅結(jié)合能力缺失4,如 D58H,G631R,Q692K 和 G969S 等突變24; 但仍有一些突變體殘存部分亞鐵氧化酶活性,能與 Fpn 相結(jié)合,但比野生型 Cp 結(jié)合 Fpn 效率低( I9F,Q146E,F198S,W264S,A331D,G606E,G876A) ; 在一位年輕的雜合的重度錐體外運(yùn)動失調(diào)患者身上發(fā)現(xiàn)了 Cp R701W 突變,該突變導(dǎo)致Cp 不能結(jié)合銅,但是當(dāng)含銅的谷胱甘肽或含銅的

12、三磷酸腺苷酶( Ccc2p,為 ATP7B 的同源基因) 與其一起表達(dá)時(shí),Cp R701W 可以產(chǎn)生 holo - Cp 并使 Fpn 分子穩(wěn)定,但這種穩(wěn)定狀態(tài)需要一定的 Cp活性水平才能維持25,說明如果參與金屬結(jié)合的ATP7B 基因不受損傷,Cp 基因的活性可以恢復(fù)。Cp R701W 也會造成大量活性氧的產(chǎn)生,但其具體機(jī)制仍不清楚。 治療遺傳性銅藍(lán)蛋白缺乏癥的關(guān)鍵是有效地進(jìn)行鐵清除,通過注射靜脈含 Cp的血漿和去鐵胺,可使肝中鐵的濃度下降。 5. 2 銅藍(lán)蛋白與 Wilson 疾病 威爾遜氏病( WD,肝豆?fàn)詈俗冃? 歸因于ATP7B( 位于 13 號染色體上) 的突變,它編碼一個 ATP

13、 依賴型的銅跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?該蛋白主要負(fù)責(zé)將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到兩條途徑中,一條途徑用來與 apo- Cp 相結(jié)合形成 holo - Cp; 另一條是將肝中多余的銅隨膽汁排出肝臟,因而 ATP7B 功能的缺陷不僅會影響 Cp 的合成,還導(dǎo)致銅在肝臟和腦等器官中積累10. 研究發(fā)現(xiàn),ATP7B 基因突變熱點(diǎn)在不同人群之間有顯著差別。 在西方患者中主要是3207 位的堿基 CA 的點(diǎn)突變導(dǎo)致組氨酸被谷氨酰胺所替代,而在中國主要的基因突變位點(diǎn)則是第八外顯子上的 2333 基因 GT 的點(diǎn)突變,使精氨酸被亮氨酸所取代26. 傳統(tǒng)的 WD 病理學(xué)認(rèn)為 ATP7B 突變會造成銅從細(xì)胞排出障礙,從而發(fā)生肝銅過載、肝細(xì)胞凋

14、亡以及銅溢出到腦脊髓液中,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷27. 但也有其他的病理學(xué)理論指出,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中 ATP7B 障礙可能導(dǎo)致產(chǎn)生受損Cp 進(jìn)而導(dǎo)致 Fe 的流出17,情況類似于遺傳性 Cp缺乏癥28. 威爾遜氏病必須進(jìn)行藥物終身治療,嚴(yán)重者可以進(jìn)行肝移植。 5. 3 銅藍(lán)蛋白與其他相關(guān)疾病 Cp 的超氧陰離子自由基清除作用,使它具有一定的抗炎效應(yīng),因而被作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,在炎癥反應(yīng)、外科創(chuàng)傷或者感染時(shí) Cp 的濃度將會加倍。 許多病理?xiàng)l件下 Cp 可以升高,如 1 型和2 型糖尿病、嚴(yán)重不穩(wěn)定型心絞痛等心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。 而在某些病理情況下( 如 Wilson病中) Cp 卻下

15、降3. 近期研究顯示,Cp 也介導(dǎo)房顫的炎癥通路29. 阿爾茨海默病是由氧化應(yīng)激效應(yīng)對機(jī)體造成氧化損傷而產(chǎn)生的疾病,當(dāng) Cp功能障礙或其合成紊亂時(shí),勢必引起體內(nèi)銅的蓄積,因此 Cp 也與阿爾茨海默病有關(guān)30. 另外,腫瘤生長需要血管生成,新血管的形成需要大量的銅,高濃度的 Cp 是銅離子的最好來源13. 因此,Cp 在惡性腫瘤的形成中有重要的作用,從癌癥的臨床治療研究方面也證實(shí) Cp 是一個有用的癌癥治療指標(biāo)31.臨床上,銅藍(lán)蛋白對某些肝、膽、腎等疾病的診斷也具有一定意義。 例如,Wilson 病患者血清銅藍(lán)蛋白含量降低,超過 50% 的肝轉(zhuǎn)移瘤、腫瘤引起膽道阻塞及膽石癥病人血清銅藍(lán)蛋白增高。

16、腎病綜合征時(shí),血清銅藍(lán)蛋白降低。 其他如一些傳染病、白血病、缺鐵性貧血病也可引起銅藍(lán)蛋白增高。 現(xiàn)在已經(jīng)有商品化的測定銅藍(lán)蛋白含量的診斷試劑盒在使用。 6 銅藍(lán)蛋白的演化 含銅結(jié)合位點(diǎn)的氧化酶家族分為單銅和多銅氧化酶家族。 單銅氧化酶包括菌藍(lán)蛋白( Rusticya-nin) 和杯蛋白 cupredoxin ( 如根瘤素 nodulins 和dinodulins) ,它們都只含有一個銅結(jié)合位點(diǎn) T1Cu( 亦稱之為 blue copper binding domain,BCB do-main) ,已發(fā)現(xiàn)菌藍(lán)蛋白主要介導(dǎo)細(xì)胞色素 C 和終端的細(xì)胞色素氧化酶之間電子傳遞,而杯蛋白在植物根部發(fā)育起作

17、用。 銅藍(lán)蛋白是屬于多銅氧化酶蛋白家族( MCP) 的成員,含有 BCB 位點(diǎn)以及結(jié)構(gòu)域之間呈三角形狀的銅離子連接位( interdo-main copper binding site,IDCB site) ,主要包括 1個 T2Cu 和兩個 T3Cu 以及 8 個組氨酸殘基4. 這個家族成員根據(jù)藍(lán)銅結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域( BCB) 的組成和功能分為 3 大類,一類是亞硝酸還原酶( 含有 2 個結(jié)構(gòu)域) ,一類是漆酶和抗壞血酸氧化酶( 含有 3 個結(jié)構(gòu)域) ,一類是銅藍(lán)蛋白( 含有 6個結(jié)構(gòu)域) . 進(jìn)化分析顯示銅藍(lán)蛋白的 6 個結(jié)構(gòu)域主要聚為兩簇,1、3、5 結(jié)構(gòu)域聚為 1 簇,2、4、6結(jié)構(gòu)域聚為 1 簇,提示它們的祖先可能為 2 域蛋白29. 根據(jù)單銅和多銅氧化酶結(jié)構(gòu)比較分析的結(jié)果,認(rèn)為多銅氧化酶家族最初始于單銅結(jié)構(gòu)域的復(fù)制,形成含有兩個結(jié)構(gòu)域的 MCO,同時(shí)伴隨BCB 位點(diǎn)的復(fù)制以及 T2Cu 和 T3Cu 的產(chǎn)生,后兩者組成了 IDCB 位點(diǎn)。 其進(jìn)化的路徑如下: 單銅氧化酶最先出現(xiàn),然后出現(xiàn)2 域蛋白,包含2 個 BCB位點(diǎn)和 1 個 IDCB 位點(diǎn)。 隨后,第一結(jié)構(gòu)域中的BCB 位點(diǎn)缺失,形成 2dMCO - B. 如果一個單獨(dú)結(jié)構(gòu)域插入,則形成 AAO、漆酶等三域 MCO,而2dMCO - B 經(jīng)過兩次復(fù)制形成銅藍(lán)蛋白