昆明醫(yī)科大學教案

1、PAGE PAGE 3昆 明 醫(yī) 科 大 學 教 案教學部門： 基礎醫(yī)學院 系： 生物化學與分子生物學 教師姓名： 授課時間： 課程名稱分子生物學實驗技術年級2015級碩士研究生專業(yè)授課教師職稱課 型實驗課學時15授課題目實驗3 小鼠腦組織總RNA提取、RT-PCR制備cDNA及DNA克隆教材（名稱、主編、出版社、出版時間、版本）生物化學與分子生物學實驗教程 朱月春 楊銀峰主編，科學出版社，2015，第一版教學目的與要求：實驗三主要完成對小鼠腦組織總RNA的提取、RT-PCR擴增特定目的DNA片段、載體及目的DNA的體外連接和轉(zhuǎn)化、陽性重組體的篩選及克隆。要求同學具備相關的分子生物學理論基礎；

2、預習實驗教程內(nèi)容，更好地理解并完成實驗操作；能科學嚴謹?shù)胤治鰧嶒灲Y果。教學重點、難點：一、重點內(nèi)容：1.掌握組織總RNA提取的基本原理和方法2.掌握RNA質(zhì)量分析的原理3.掌握RT-PCR獲取真核生物目的DNA片段的原理及方法4.掌握酶切、連接、感受態(tài)細胞制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法5.掌握篩選陽性重組體的常用方法及其原理二、難點內(nèi)容：1.提取過程中RNA的純度及質(zhì)量控制2.限制性核酸內(nèi)切酶的選擇及酶切位點的設計3.常見陽性重組體的篩選方法及原理（如標志補救法等）4.陽性重組體中目的DNA片段正向插入、反向插入的判斷教學方法：多媒體、啟發(fā)式、結合教師研究經(jīng)歷、加強實驗操作指導、示范，特別是對不同實驗結

3、果的可能影響因素分析的指導。多媒體及板書設計要點：多媒體要圖文并茂，避免大篇幅的文字?；緝?nèi)容輔助手段和時間分配一、動物組織總RNA提取的基本原理及注意事項1. 異硫氰酸胍一步分離法提取總RNA2. 防止RNA降解的注意事項二、RNA質(zhì)量分析1. 紫外分光光度法對總RNA質(zhì)量進行分析2. 變性瓊脂糖凝膠電泳對總RNA完整性進行判斷三、RT-PCR1.mRNA質(zhì)和量的差異反映了細胞功能形態(tài)及狀態(tài)的差異2.以總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與之序列互補的DNA（即，cDNA）3.再經(jīng)PCR擴增，獲取相應目的基因DNA片段（構建Hind 的正向和反向切割位點）四、RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及純

4、化1.瓊脂糖凝膠電泳對不同大小DNA片段進行分離2.切下含目的DNA片段的凝膠，經(jīng)硅膠層析過濾純化五、載體和RT-PCR純化產(chǎn)物的快速酶切及電泳鑒定1.載體pUC18-GFP質(zhì)粒圖譜結構（構建6His篩選標簽和GFP篩選標記）2.選擇限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI (GGATCC)對載體和目的DNA進行酶切3.瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測六、酶切產(chǎn)物的體外連接及轉(zhuǎn)化1.DNA連接酶將酶切后的載體和目的DNA片段連接成重組DNA分子2.感受態(tài)細胞的制備3.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化七、陽性重組體的篩選及鑒定1.氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)入了外源DNA的宿主菌2.酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性重組體第一天第二天第三天注：主要包括具體教學內(nèi)容與時間安排，教學輔助手段的運用，主要專業(yè)外語 詞匯，教學內(nèi)容的補充等。 小 結 實驗二主要完成對小鼠腦組織總RNA的提取、RT-PCR擴增特定目的DNA片段、載體及目的DNA的體外連接和轉(zhuǎn)化、陽性重組體的篩選及克隆。復習思考題、作業(yè)題1. RT-PCR中RT（逆轉(zhuǎn)錄）步驟起什么作用？哪一個引物在其中起作用？為什么？2. RT-PCR中PCR步驟起什么作用？為什么？3. 一般提取純化RNA是為了分析利用其中的mRNA，而