DB32-T 3762.16-2021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第16部分：核酸數(shù)字PCR法-（高清現(xiàn)行）

1、ICS 13.100C 50DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T 3762.162021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第 16 部分：核酸數(shù)字PCR 法Technical specifications for SARS-CoV-2 detectionPart 16: Novel coronavirus nucleic acid digital PCR test procedure2021-12- 09 發(fā)布2022 - 01 - 09 實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB32/T 3762.162021 PAGE * ROMAN II目次 HYPERLINK l _bookmark0 前言II范圍1規(guī)范

2、性引用文件1術(shù)語和定義1縮略語1原理1基本要求2試劑與材料2儀器與設(shè)備2操作步驟2前言DB32/T 3762新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范目前分為以下部分：第1部分：生物樣本采集、運(yùn)輸和保存；第2部分：病毒分離與鑒定；第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序；第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)程序；第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測(cè)程序；第7部分：空氣樣本檢測(cè)與評(píng)估；第8部分：物體表面檢測(cè)與評(píng)估；第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測(cè)與評(píng)估；第10部分：微量血清中和試驗(yàn)；第11部分：全基因組高通量測(cè)序；第12部分：藥物體外抗病毒效果測(cè)定；第13部分：疊

3、氮溴化丙錠-熒光PCR檢測(cè)程序；第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測(cè)程序；第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)程序；第16部分：核酸數(shù)字PCR法；第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品；第18部分：規(guī)?；怂釞z測(cè)程序。本文件為 DB 32/T 3762 的第16部分。本文件按照 GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件主要起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)院、蘇州市疾病預(yù)防控制中 心、泰州市疾病預(yù)防控制中心、蘇州銳訊生物科技

4、有限公司、北京新羿生物科技有限公司。本文件主要起草人：洪捷、林婧、蔣云宇、周愷、周連、王慎驕、朱立國、王尚君、范宇宸、朱寶 立、王雅琦、李家琛、董嘉、祝令香、王楠。DB32/T 3762.162021 PAGE 4新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第 16 部分：核酸數(shù)字PCR 法范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸數(shù)字 PCR 檢測(cè)方法。本文件適用于新冠病例、一般人群和重點(diǎn)人群的生物樣本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血標(biāo)本、肛 拭子等，以及其他需要檢測(cè)的樣本的核算數(shù)字 PCR 檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用

5、于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求DB 32/T 3762.3新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第 3 部分：核酸熒光 PCR 檢測(cè)程序術(shù)語和定義本文件沒有界定的術(shù)語和定義?？s略語下列縮略語適用于本文件。數(shù)字 PCR：數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction） ORF1a/b：開放閱讀框 1a/b（open reading frame）dNTPs：脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 人 RNase P 基因：人核糖體核酸酶基因

6、（Ribonuclease P）原理一種對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng) 單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)而計(jì)算出原始樣本中目標(biāo)分子濃度。目前數(shù)字 PCR 技術(shù)包括芯片式和微滴式兩種，芯片式通過微流控芯片實(shí)現(xiàn)對(duì)原始反應(yīng)體系的分割，該方法具有穩(wěn)定性好，均一性好的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)成本相對(duì)較高。微滴式通過產(chǎn)生微小油包水體系實(shí) 現(xiàn)體系的分割，該方法有反應(yīng)速度快，檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR的定量檢測(cè)，本標(biāo)準(zhǔn)通過數(shù)字PCR

7、的擴(kuò)增反應(yīng)直接得出新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的拷貝數(shù)?；疽髮?shí)驗(yàn)室資質(zhì)及級(jí)別檢測(cè)工作應(yīng)在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。生物安全要求遵照 GB 19489 和 DB 32/T 3762.3 規(guī)定執(zhí)行。操作人員資質(zhì)及防護(hù)實(shí)驗(yàn)過程中的個(gè)人防護(hù)遵照 GB 19489 第8條和 DB 32/T 3762.3 規(guī)定執(zhí)行。試劑與材料新冠病毒核酸提取試劑盒：應(yīng)當(dāng)選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的試劑，建議選擇磁珠法、膜吸 附法等進(jìn)行核酸提取。新冠病毒數(shù)字 PCR 預(yù)混液：含有鎂離子，dNTPs、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶和 DNA 聚合酶等組分的數(shù)字 PCR 預(yù)混液，推薦根據(jù)不同的數(shù)字 PCR 方法和

8、儀器選擇不同的試劑。引物序列和探針：檢測(cè)新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的引物和探針序列見表 1。表 1 新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的引物和探針序列標(biāo)靶名稱序列新 型 冠 狀 病 毒ORF1ab基因上游引物CCCTGTGGGTTTTACACTTAA下游引物ACGATTGTGCATCAGCTGA探針5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3新型冠狀病毒N基因上游引物GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT下游引物CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG探針5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3

9、儀器與設(shè)備生物安全柜。生物安全型離心機(jī)。渦旋振蕩器。恒溫金屬浴。核酸提取儀。數(shù)字 PCR 儀。操作步驟樣本前處理按照DB 32/T 3762.3 中的 7.1 規(guī)定執(zhí)行。核酸提取按照DB 32/T 3762.3 中的 7.2 規(guī)定執(zhí)行。數(shù)字 PCR 擴(kuò)增方法數(shù)字 PCR 反應(yīng)體系數(shù)字PCR儀反應(yīng)體系的總體積根據(jù)不同廠家、不同型號(hào)的儀器設(shè)備需進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，并保持各引 物探針組分終濃度不變。數(shù)字 PCR 反應(yīng)程序數(shù)字PCR反應(yīng)程序如表2，不同方法和不同儀器設(shè)備及試劑反應(yīng)程序可能存在差異，需進(jìn)行調(diào)整。表 2 數(shù)字 PCR 反應(yīng)程序步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)150 60 min1 cycle295 10 m

10、in1 cycle395 30 s40 cycles55 1 min498 10 min1 cycle54 5 min1 cycle對(duì)照數(shù)字 PCR 反應(yīng)的設(shè)定試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。用含 2019-nCoV ORF1ab 基因特異片段的病毒樣顆粒、含2019-nCoV N基因特異片段的病毒樣顆粒和含人 RNase P 基因特異片段的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。用無核酶水作為陰性對(duì)照。質(zhì)量控制與結(jié)果分析質(zhì)量控制以下要求其中一條不符合，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，重新進(jìn)行試驗(yàn)應(yīng)從核酸提取開始：樣本人 RNase P 基因有熒光信號(hào)檢出；陰性對(duì)照無熒光信號(hào)；陽性對(duì)照兩個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab 、N）熒光信號(hào)均超過設(shè)定閾值。陽性判定實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：同一份樣本中新型冠狀病毒 2 個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab 、 N）數(shù)字 PCR 檢測(cè)結(jié)果均 100 copies/mL。如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo) 100 copies/mL 的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測(cè)。如果單靶標(biāo)