腫瘤的分子診斷

1、腫 瘤 的 分 子 診 斷 器官病理學(xué) 組織病理學(xué) 細(xì)胞病理學(xué) 免疫病理學(xué) 分子病理學(xué) 應(yīng)用分子診斷技術(shù)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制及生物學(xué)行為能從分子水平上加以認(rèn)識(shí)，其范圍覆蓋分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。研究較為深入當(dāng)屬癌基因、抑癌基因及其它相關(guān)基因。 第一節(jié) 腫瘤基因過(guò)表達(dá)及其檢測(cè) 一、基因過(guò)表達(dá)的形式 癌基因一般為單拷貝基因，有其編碼的蛋白質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)制過(guò)程中形成多個(gè)拷貝，形成雙微粒染色體和均染區(qū)，各種基因的擴(kuò)增常產(chǎn)生基因產(chǎn)物過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)為RNA和蛋白質(zhì)量的增加。二、基因過(guò)表達(dá)的檢測(cè)（一）表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry） 酶聯(lián)免

2、疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 蛋白印跡（Western blot） 流式細(xì)胞儀測(cè)試法 （二）基因擴(kuò)增的檢測(cè) 基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA的增加 分子診斷檢測(cè)方法: 原位雜交 （in situ hybridization,ISH） 熒光原位雜交 （fluorescence in situ hybridization, FISH） 原位PCR（in situ polymerase chain reaction） Southern雜交（DNA雜交） Northern雜交（RNA雜交） 原位雜交（in situ hybridiza

3、tion,ISH） 將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，屬固相核酸分子雜交范圍，它用標(biāo)記的DNA或RNA為探針在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特異的DNA或RNA序列。 優(yōu)點(diǎn)：1、具有分子雜交的特異性強(qiáng)、靈敏高特點(diǎn)，同 時(shí)又具有組織細(xì)胞化學(xué)染色的可見(jiàn)性；2、即可用新鮮組織，又可用石蠟包埋組織作回 顧性研究；3、所需樣本量少，可用活組織細(xì)針穿刺和細(xì)胞 涂片；4、應(yīng)用范圍廣泛，可對(duì)特定的基因（如癌基因、 病毒基因）DNA、mRNA的表達(dá)進(jìn)行定位、定 性和定量。組織細(xì)胞分布和雜交電鏡的亞細(xì)胞 定位研究。 分類：DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交RNA-RNA雜交直接法間接法同位素標(biāo)記非同位素標(biāo)記 生物素、地

4、高素、熒光素等雙重標(biāo)記原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交（FISH） 將熒光素標(biāo)記克隆的DNA片段與染色體或細(xì)胞間期染色質(zhì)雜交，以測(cè)試該特定的DNA片段是否有缺失或擴(kuò)增。 比較基因組雜交（comparative genome hybridization CGH） 即將熒光素分別標(biāo)記在去除了重復(fù)序列的腫瘤及正常細(xì)胞基因組DNA上，然后分別與正常染色體進(jìn)行原位雜交，對(duì)該二種不同探針與各個(gè)染色體雜交后的信號(hào)進(jìn)行比較，以了解該腫瘤中細(xì)胞在不同染色體上缺失或擴(kuò)增的狀態(tài)。 原位PCR（in situ polymerase chain reaction） 將PCR擴(kuò)增技術(shù)和原位雜交技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶核苷

5、酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使基因拷貝數(shù)放大，再通過(guò)原位雜交方法檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)靶核苷酸進(jìn)行定性、定位、定量分析。 一種敏感性高、特異性強(qiáng)，能在組織細(xì)胞原位進(jìn)行低拷貝數(shù)基因定性的研究方法。Southern雜交： 一種DNA特定序列定位技術(shù)。 以組織或細(xì)胞中獲取基因組DNA，用一種或多種限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)印、原位變性固定于一固相支持物，用已標(biāo)記的特異性DNA或RNA的探針與固定有DNA的固相支持膜雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影或化學(xué)發(fā)光自顯影，對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。 Northern blot： 用于分析細(xì)胞總RNA或含有poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交

6、技術(shù)，可了解被測(cè)靶基因在細(xì)胞內(nèi)有無(wú)過(guò)表達(dá)。 注意問(wèn)題：1、提取組織或細(xì)胞中的RNA，不需酶切而直接采用電泳。2、操作過(guò)程要嚴(yán)格控制RNase的污染。3、RNA只與雙鏈DNA樣本中的一條鏈互補(bǔ)，因此雜交時(shí)所需雙鏈DNA探針的量加大；如采用單鏈探針，無(wú)論是DNA抑或RNA探針，或是寡核苷酸探針，均需確定所用探針能與目標(biāo)RNA互補(bǔ)。第二節(jié) 基因突變及其檢測(cè) 癌基因和抑癌基因突變是腫瘤發(fā)生中出現(xiàn)頻率較高的分子事件，突變的結(jié)果則使癌基因激活或抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。 基因突變是一復(fù)雜的過(guò)程，不僅在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到突變基因，對(duì)于某些癌前病變或癌前狀態(tài)的組織細(xì)胞中也存在不同形式和不同程

7、度的基因突變，在同一腫瘤的不同發(fā)展階段，可能會(huì)涉及多種基因不同形式的突變，說(shuō)明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。 一、基因突變的形式 點(diǎn)突變（point mutation） 基因缺失(gene losses) 基因異位或重排 （gene translocation and rearrangment）（一）點(diǎn)突變（point mutation） 指基因在特異位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物學(xué)功能。 錯(cuò)義突變（missence） 無(wú)義突變（nonsence） 終止碼突變（stop codon） 移碼突變（frame s

8、hift）等 （二）基因缺失 (gene losses) 基因片段缺失是另一種主要的突變形式，缺失的范圍差別較大，可以是1-2個(gè)堿基，也可以是一個(gè)片段甚或一個(gè)外顯子的缺失?；蚱蔚娜笔Э墒乖摶蚣せ?，轉(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學(xué)功能喪失?；蛉笔c腫瘤的臨床病理及生物學(xué)行為密切相關(guān)。 基因缺失中較為頻發(fā)的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因雜合型和純合型丟失。 基因缺失是腫瘤形成的原因還是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果，尚值得深入探討。 （三）基因異位或重排 （gene translocation and rearrangement） 某一基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個(gè)位置上稱

9、為易位或重排。易位與重排易使癌基因被激活，或是抑癌基因失活，從而使細(xì)胞惡變。 細(xì)胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進(jìn)子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時(shí)，可使細(xì)胞癌基因于正常的抑制子分開(kāi)而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。 (四) 其它類型的基因突變插入甲基化染色體非組蛋白改變 等 癌基因或抑癌基因甲基化（methylation）狀態(tài)改變與腫瘤發(fā)生存在密切關(guān)系。 二、基因突變的檢測(cè)方法 目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立在PCR的基礎(chǔ)上，由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，自動(dòng)化程度越來(lái)

10、越高，分析時(shí)間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有了很大提高。 （一） PCR-SSCP法 單鏈構(gòu)像多態(tài)性 (single-strand conformational polymorphism, SSCP) 基本原理： 單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其堿基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上移動(dòng)速度改變，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)不同的遷移象。 該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過(guò)序列分析來(lái)確定。對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來(lái)做SSCP會(huì)提高其靈敏度。 該法簡(jiǎn)單快速，被廣泛

11、用于未知基因突變的檢測(cè)。由于該法的簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。 應(yīng)用PCR-SSCP檢測(cè)點(diǎn)突變已見(jiàn)報(bào)道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，檢測(cè)的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測(cè)抑癌基因p53突變最常用的方法。（二）雜合雙鏈分析法 （heterodulex analgsis, HA） 直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。 HA對(duì)一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，二者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高近100%。 （三）突變體富集

12、PCR （mutant-enriched PCR） 利用癌基因或抑癌基因某個(gè)編碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)二次的巢式PCR來(lái)擴(kuò)增包括存在酶位點(diǎn)編碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。 （四）變性梯度凝膠電泳法 （denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE） 雙鏈DNA在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠中自上而下所含變性劑濃度線性增長(zhǎng)，DNA片段進(jìn)行到變性劑某一濃度，與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DN

13、A發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，但解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同時(shí)間解鏈，則因影響電泳速度變化的程度而被分離。 在DGGE基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用溫度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE），由于DGGE和TGGE是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，均需專用的電泳裝置。（五）化學(xué)切割錯(cuò)配法 （Chemical cleavage of mismatch,CCM） 基本原理： 將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺或哌啶切割，錯(cuò)配的T能被

14、四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。 該法檢出率很高，也是檢測(cè)片段最長(zhǎng)的方法。應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度。該法中的化學(xué)試劑有毒，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測(cè)法（Carbodiimide，CDI），CDI為無(wú)毒物質(zhì)。 （六）等位基因特異性寡核苷酸分析法 (allele-specific oligonucleotide ASO) 設(shè)計(jì)一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR擴(kuò)增的樣品DNA雜交。 可以選用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時(shí)以野生型探針為對(duì)照，如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交帶，則表示樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變。 （七）DNA芯片技

15、術(shù)（DNA Chip） 基本原理： 將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一塊固體材料如玻璃片、硅片（集成電路板）上，彼此之間重疊一個(gè)堿基，并覆蓋所需測(cè)定的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交，由于至少存在一個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過(guò)共聚焦顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變。 可用于基因定位、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等，在基因突變檢測(cè)方面DNA芯片也有廣闊的前景。（八）RNA酶A切割法 制備RNA探針，與待測(cè)DNA或RNA片段雜交，在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA ：RNA或RNA ：DN

16、A的錯(cuò)配堿基可被RNase A切割，切割產(chǎn)物可通過(guò)變性凝膠電泳分離。 該法可用于1-2kb的大片段進(jìn)行檢測(cè)，并能確定突變位點(diǎn)。 （九）染色體分析（analysis of chromosome） 1、熒光原位雜交技術(shù)（FISH） 2、寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)（Oligonncleotide primed in situ DNA synthesis, PRINS） 重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)（repeated PRINS） 多色原位引物標(biāo)記（multicolor PRINS） 3、比較基因組雜交 （comparative genomic hybridization, CGH） 基本原理： 用不同的

17、非同位素標(biāo)記物，分別標(biāo)記被檢測(cè)的基因組DNA（常為腫瘤DNA）和正常人基因組DNA，兩者以1：1混合后制備探針，共同與正常人中期染色體標(biāo)本進(jìn)行染色體原位抑制雜交，雜交后對(duì)不同熒光物分別進(jìn)行檢測(cè)，以每條染色體長(zhǎng)軸各位點(diǎn)的被測(cè)DNA與正常基因組DNA熒光強(qiáng)度比，反映兩組DNA不同序列的拷貝數(shù)。 只能檢測(cè)腫瘤基因組中相對(duì)于正?；蚪M平均拷貝數(shù)的變化，而不能檢測(cè)易位、倒位及其它拷貝數(shù)沒(méi)有變化的染色體畸變，基因重排和點(diǎn)突變，也不能檢出小于2Mb的缺失。 （十）DNA序列分析（DNA sequencing） 應(yīng)用各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的基因突變，最后都需要用DNA序列分析才能確定突變的類型及突變的位置 。

18、 直接測(cè)序法（direct sequencing，DS） PCR循環(huán)測(cè)序法 雙脫氧終止法基本原理 第三節(jié) 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 一、等位基因不平衡 應(yīng)用同一腫瘤的正常體細(xì)胞（常分為血細(xì)胞或腫瘤旁正常組織）和腫瘤細(xì)胞的DNA，檢測(cè)DNA多態(tài)性座位上等位基因不平衡性。當(dāng)兩個(gè)等位基因的相關(guān)性密度在正常與腫瘤細(xì)胞之間出現(xiàn)顯著性差異時(shí)，就提示腫瘤細(xì)胞中多態(tài)序列座位處出現(xiàn)突變。 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 當(dāng)DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，或當(dāng)DNA片段的插入、缺失或重復(fù)，可使基因組DNA經(jīng)限制性

19、內(nèi)切酶水解后發(fā)生片段長(zhǎng)度改變。因?yàn)檫@些特異基因片段是限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的，在不同個(gè)體間可出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的限制性片段類型，故稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 RFLP的研究可以觀察到同一患者的正常細(xì)胞DNA中存在二個(gè)等位基因，而腫瘤組織DNA中僅存在一個(gè)等位基因，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞單條染色體中一個(gè)等位基因缺失，這種改變稱為雜合缺失（loss of heterozygosity, LOH）。 人類基因組中含有一些復(fù)雜序列家族，有些重復(fù)序列分散在基因組中，有些是以一系列短的重復(fù)序列排列組成高變區(qū)，其串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)可相差很多，出現(xiàn)可變數(shù)的串聯(lián)重復(fù)，約占單倍體DNA的10%，基本上位于非編碼區(qū)，重復(fù)單位以6-70bp

20、為多，重復(fù)次數(shù)約6-100次，稱為數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat, VNTR）。由于高變區(qū)的長(zhǎng)度變化很大，使高變區(qū)兩側(cè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的固定位置隨高變區(qū)的大小而發(fā)生相對(duì)位移，由此造成RFLP，稱之為VNTR多態(tài)性。 采用RFLP技術(shù)可直接分析、測(cè)定人體癌組織中某些基因在染色體上的變異及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。精確位點(diǎn)的RFLP分析還是發(fā)現(xiàn)新的腫瘤基因的有效研究手段。 二、RFLP的檢測(cè) 采集配對(duì)樣本，既腫瘤組織和同一患者的正常體細(xì)胞（可用周圍血細(xì)胞或腫瘤旁組織），分別提取基因組DNA，特定的內(nèi)切酶酶切、電泳、轉(zhuǎn)印，與標(biāo)記探針進(jìn)行Sout

21、hern雜交后，分析等位基因的變化。 PCR-RFLP 一種PCR結(jié)合RFLP的方法。 首先設(shè)計(jì)PCR引物，并使其擴(kuò)增片段包含多態(tài)性限制性酶切位點(diǎn)序列，PCR擴(kuò)增后，用相應(yīng)的酶酶切PCR產(chǎn)物，直接電泳以觀察酶切片段的長(zhǎng)度多態(tài)性變化。 該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，以及DNA樣本用量低 。第四節(jié) 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析 一、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤 小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA），又稱VNTR。 微衛(wèi)星DNA，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple repeat sequence，SRS）。 SRS是一種最常見(jiàn)的重復(fù)序列之一，具有豐富的多態(tài)性、高度雜合性、重組率低等優(yōu)點(diǎn)。最常見(jiàn)的為雙核苷酸重復(fù)

22、，即(AC)n和(TG)n。在n14時(shí)，2bp重復(fù)序列在人群中就呈高度多態(tài)性。 SRS廣泛存在于原核和真核基因組中，約占真核基因組的5%，是近年來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的DNA多態(tài)性標(biāo)志之一。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MI）是指簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失，特別是在DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺損的腫瘤基因組中常顯示大量的MI。 MI可能是腫瘤細(xì)胞的一種重要分子標(biāo)志。 二、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè) 基本方法為首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增所需的雙核苷酸重復(fù)序列，然后用凝膠電泳分析DNA序列。分析時(shí)條帶長(zhǎng)度的確定可用已知長(zhǎng)度梯度標(biāo)準(zhǔn)帶為參考，也可以用頻率最高的帶（優(yōu)勢(shì)帶）為基準(zhǔn)。 MI

23、分析是與PCR技術(shù)聯(lián)系在一起的，由此也衍生不同的方法和引物標(biāo)記物。 第五節(jié) 端粒酶與腫瘤的關(guān)系及檢測(cè) 一、端粒酶與腫瘤 染色體端粒（telomere）是位于細(xì)胞染色體末端的一種有2-20kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n及一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。人的端粒長(zhǎng)度大約15kb，隨著細(xì)胞的每次分裂，端粒逐漸縮短，每次丟失50-200個(gè)核苷酸。端粒的縮短限制了細(xì)胞增殖能力，對(duì)端粒長(zhǎng)度的計(jì)算是計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)的生物鐘。端粒在染色體定位、復(fù)制、保護(hù)和控制細(xì)胞生長(zhǎng)壽命等方面具有重要作用，并與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化密切相關(guān)。 端粒序列的復(fù)制依賴于一種特殊的DNA聚合酶即端粒酶（telomeras

24、e）的作用。端粒酶為由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），含有端粒重復(fù)序列的模板，即以自身RNA組分為模板，復(fù)制合成端粒序列。 正常細(xì)胞周期中，細(xì)胞每分裂一次，端粒子鏈即縮短一次，經(jīng)過(guò)若干分裂周期后，端粒縮短到臨界長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入凋亡，端粒酶檢測(cè)為陰性。 癌細(xì)胞在某些機(jī)制作用下，啟動(dòng)端粒酶表達(dá)而使染色體端粒穩(wěn)定維持在一定長(zhǎng)度，從而使癌細(xì)胞得以增殖，并獲得永生化，此時(shí)端粒酶檢測(cè)陽(yáng)性。 端粒的長(zhǎng)度不能作為衡量端粒酶活性的可靠標(biāo)記，而端粒酶活性表達(dá)的高低可作為惡性腫瘤發(fā)展的衡量指標(biāo)。 端粒酶的表達(dá)水平有可能為腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后等提供指標(biāo)，并有可能以抑制端粒酶表達(dá)為手段作為腫瘤

25、治療的新方法。 二、端粒酶活性的檢測(cè)TRAP法（telomeric repeat amplification protocal，TRAP） ELISA法TRAP法（telomeric repeat amplification protocal，TRAP） 首先從腫瘤細(xì)胞或組織中制備端粒酶提取液，然后進(jìn)行TRAP反應(yīng)，即在含有一條引物、dNTP和TRAP緩沖液的反應(yīng)體系中，加入端粒酶提取液，使端粒以其RNA組分為模板催化合成端粒DNA重復(fù)序列，并以此為模板，加入另一條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中加入標(biāo)記的dATP（同位素、熒光素或地高辛等標(biāo)記物），擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳、放射自顯形（同位素為標(biāo)

26、記物）后分析，以熒光素為標(biāo)記物者可通過(guò)掃描儀分析熒光曲線。應(yīng)用地高辛標(biāo)記試劑盒，還可進(jìn)行半定量分析。 ELISA法 利用端粒酶在生物素標(biāo)記的引物上加入多個(gè)6核苷酸端粒重復(fù)序列，反應(yīng)產(chǎn)物用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再與鏈霉菌抗生物素蛋白包被的微量滴定板結(jié)合，與地高辛標(biāo)記的探針雜交，產(chǎn)生的有色底物用酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果。 該法省時(shí)簡(jiǎn)便。 結(jié) 語(yǔ) 分子診斷是具有劃時(shí)代意義的檢測(cè)手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中正發(fā)揮著巨大的作用，在腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究中也顯示了極大的優(yōu)越性和應(yīng)用前景。 分子診斷的任務(wù)不完全在于去尋找和發(fā)現(xiàn)新的理論、機(jī)制，更應(yīng)致力于如何將實(shí)驗(yàn)研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用階段。 需解決的問(wèn)題如： 建立費(fèi)用

27、低廉、結(jié)果可靠、操作方便的分子診斷技術(shù)； 建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作程序和標(biāo)準(zhǔn)化的分子診斷實(shí)驗(yàn)室，實(shí)現(xiàn)分子診斷標(biāo)準(zhǔn)化； 除了要在診斷技術(shù)方面逐步實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化外，對(duì)腫瘤診斷指標(biāo)也要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 隨著人類基因組計(jì)劃和后基因組（蛋白質(zhì)組）計(jì)劃的實(shí)施，分子診斷也將得到進(jìn)一步完善和成熟，使人類最認(rèn)清腫瘤的本質(zhì)并攻克它。 相關(guān)技術(shù)參考文獻(xiàn)原位雜交 Herrington CS. Mol Pathol, 1998; 51: 8 Levy ER and Herrington CS. Oxford: Oxford University Press Inc, 1995: p25熒光原位雜交 Water JJ. et al.

28、 Mol Pathol, 1998; 51: 62 Habeebu SSM, et al. Mol Biol Med, 1990; 7: 423Southern blot Northern blot 許良中，實(shí)用腫瘤病理方法學(xué)。 上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1997；p129原位PCR Anderson V. Cell Vision, 1994; 1: 60PCR-SSCP法 Sheffield VC, et al. Genomics, 1993; 16: 325雜合雙鏈分析法 White MB, et al Genomics, 1992; 12: 301突變體富集PCR Boumforth K

29、RV, et al. Mol Pathol, 1999; 52: 8變性梯度凝膠電泳 Buetow KH, et al. Pioc Natl Acad Sci USA,1992; 89: 9622化學(xué)切割錯(cuò)配法 Verpy E. Pioc Natl Acad Sci USA,1994; 91: 1873等位基因特異性寡核苷酸分析法 Saiki RK, et al. Pioc Natl Acad Sci USA,1989; 86: 6230DNA芯片技術(shù) Yershov G, et al. Pioc Natl Acad Sci USA,1996;93:4913 Hacia JG, et al.

30、Genome Res,1998; 8: 1245DNA序列分析 顏?zhàn)臃f 等，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南。 北京：科學(xué)出版社，1998；p185限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 Kressner U, et al. Br J Cancer, 1998; 77: 1848PCR-RFLP Fang DC, et al. J Clin Pathol 1998; 51: 593微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析 Arzimanoglou II, et al. Cancer, 1998; 82: 1808TRAP法 Ikeda M, et al. Cancer Res, 1998; 58: 594樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量

31、意識(shí)。8月-228月-22Saturday, August 20, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。05:51:1505:51:1505:518/20/2022 5:51:15 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。8月-2205:51:1505:51Aug-2220-Aug-22加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。05:51:1505:51:1505:51Saturday, August 20, 2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。8月-228月-2205:51:1505:51:15August 20, 2022踏實(shí)肯干，努力奮斗。2022年8月20日5:51 上午8月

32、-228月-22追求至善憑技術(shù)開(kāi)拓市場(chǎng)，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹(shù)立形象。20 八月 20225:51:15 上午05:51:158月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。八月 225:51 上午8月-2205:51August 20, 2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/8/20 5:51:1505:51:1520 August 2022好的事情馬上就會(huì)到來(lái)，一切都是最好的安排。5:51:15 上午5:51 上午05:51:158月-22專注今天，好好努力，剩下的交給時(shí)間。8月-228月-2205:5105:51:1505:51:15Aug-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)

33、安全之實(shí)。2022/8/20 5:51:15Saturday, August 20, 2022相信相信得力量。8月-222022/8/20 5:51:158月-22謝謝大家！樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。8月-228月-22Saturday, August 20, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。05:51:1505:51:1505:518/20/2022 5:51:15 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。8月-2205:51:1505:51Aug-2220-Aug-22加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。05:51:1505:51:1505:51Saturday, August 20, 2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。8月-228月-2205:51:1505:51:15August 20, 2022踏實(shí)肯干，