免疫膠體金技術

1、關于免疫膠體金技術第一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金標記技術的相關定義免疫膠體金技術 是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗 體的一種新型的免疫標記技術。膠體金標記 實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。第二張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金技術的發(fā)展Development of Immune colloidal gold technique 1939-雛形 Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。1971-作為標記物應用于免疫組織化學研究 Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結合，用直接免疫細

2、胞化學技術檢測沙門菌的表面抗原。1974-實現(xiàn)間接免疫金染色法 Romano將膠體金標記到馬抗人的IgG上，實現(xiàn)了間接免疫金染色法第三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金技術的種類及優(yōu)點快速免疫金滲濾法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫測定。 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標記結合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結合物為免疫金。A：金標記抗體B：標本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒第四張，PPT共三

3、十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 免疫層析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是繼IGFA之后發(fā)展起來的另一種固相膜免疫測定，與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用(基于層析作用的橫流 （lateral flow） )向另一端移動。移動過程中被分析物 與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結合而被固相化，無關物質則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記物顯色來判定試驗結果，以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗。第五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫膠體金技術的特點優(yōu)點：檢測方法簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結

4、果；不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練；試劑穩(wěn)定，適用于單份測定；無污染。GICA的特點是單一試劑，一步操作。小型實驗室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 成為目前“病人身邊檢驗”（point-of-care testing，POCT）中廣為應用的方法。第六張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 最近由于原料的精選和制作工藝的改進，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardiac Reader，其精密度和準確性均符合定量測定要求。 不足： 金免疫測定中應用的是單份試劑，難于

5、進行質量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應用。第七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Colloidal Gold SynthesisSolution color varies extensively with particle sizeUsually a deep red, but also dark brown/purple to light orange/yellowColloid size can be controlled by Au:Citrate ratios

6、Anywhere between 1nm - 100nm +Citrate is easily substituted by other more Au-philic molecules (i.e thiols)H2O, 100OCH2AuCl4Cit-Cit-Cit-Cit-Turkevich, et. al. Discussions Faraday Soc. 1951, No. 11 55-75.第八張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Procedure of Colloidal Gold SynthesisAdd 100 mL of 1

7、.0 % HAuCl4 to a 200 mL Erlenmeyer flask on a stirring hot plate. Add a magnetic stir bar and bring the solution to a boil To the boiling solution, add 1.5 mL of a 1% solution of trisodium citrate dihydrate, Na3C6H5O7.2H2O Stop heating when a deep red color is obtained. 第十張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Synthe

8、sis and properties of different particle size 膠體金粒徑(nm) 1%檸檬酸三鈉加入量(ml)膠體金特性 呈色 max162橙色518nm24.51.5橙色522nm411紅色525nm71.50.7紫紅535nm第十一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月TEM Images of Colloidal AuAverage particle size 17nmGood gold colloids and bad (unstable) gold colloids . 劣質金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大 第十二張，PPT共三

9、十三頁，創(chuàng)作于2022年6月How are the antibodies coupled to the gold? Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena :a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and t

10、he gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)Strongest binding suggested to be the sulfur hinge joining the the two Fc regions第十三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金顆粒帶電情況 抗體和金顆粒的耦聯(lián)（圖出處：IVD Technology） 第十四張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月SAMPLE GOLD CONJUGATION PROTOCOLAdjust the gold colloid to the proper p

11、H; Determined the minimum amount of protein ;Final conjugation Purification 第十五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Adjust the gold colloid to the proper pH 膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質等電點(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標記蛋白質的等電點略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，

12、因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.第十六張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白 與膠體金結合的最佳pH測定取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中，重復三次；每孔分別加入20ul濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH第十七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Adjust the gold colloid to the proper pH常用幾種蛋白質標記時膠體金所用的pH值第十八張

13、，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Determined the minimum amount of protein（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以OD值為縱坐標，蛋白質用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質的最適穩(wěn)定量為45g/ml。第十九張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）目測法：以目測法確定膠體金與待標

14、記蛋白質用量比例，將標記的蛋白質逐級稀釋后（由5g45g另設對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進行。第二十張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1. Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml clean plastic tubes. 2. Adjust the antibody (0.1ug/ul) to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1. 3. Add the antibody

15、 to each tube in a series from 0-150ul (ie 0-15ug in steps of 0, 1, 2, 3 .15ug). 4. Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate. 6. To each tube add 100ul of 10% NaC1 and agitate for 1 minute. 7. The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold

16、sol is indicated by the one in which the color of the gold sol does not change from red to blue upon the addition of NaCl. 第二十一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Final conjugation (IgG)Take 100ml of gold sol and adjust to Ph9Adjust the dialyzed and centrifuged antibody solution (0.1ug/ul) to pH9.2 Add the determi

17、ned amount of antibody solution dropwise to the gold while stirring rapidlyAfter 5 minutes add 10ml of filtered 10% BSA at pH9 and stir gently for 10 minutes. 第二十二張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Purification The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentr

18、ating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size .The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.The gold conjugate, if correctly made, will be stable at 4 for s

19、everal months.If long term storage is required is should be aliquoted into 1ml volumes and 20% glycerol added. It may then be frozen and kept at -20 for years. 第二十三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月膠體金免疫層析法試劑的組成第二十四張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結合

20、墊上均勻分布； 去除樣品中雜質顆粒； 調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等。樣本墊可使用化學物質進行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹?、粘性增強劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。第二十五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月結合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標結合物顆粒；-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉移到NC膜上；-保持金標結合物顆粒的穩(wěn)定性；-保證金標結合物顆粒定量完全釋放等。 第二十六張，PPT共三

21、十三頁，創(chuàng)作于2022年6月硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)： 推薦使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等國外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反應；-反應在NC膜上顯色，讀檢測結果 NC膜的重要參數(shù)： 孔徑、對稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結合力、強度、表面質量、厚度、批間均一性等。第二十七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月硝酸纖維素膜與蛋白結合的原理 主要有兩種假說： 1）首先兩者靠靜電作用力結合，然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。 2）首先兩者靠疏水作用結合，然后靠靜電作用來維持長時間結合。兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和后面長時間結合。由于結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗。第二十八張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月硝酸纖維膜的選擇膜的分類標準(m和s) m: 指的是膜孔徑， s: 以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是*s. 換算