外源性bFGF對雞形覺剝奪性近視眼球后壁組織中VIP表達(dá)的影響

1、外源性bFGF對雞形覺剝奪性近視眼球后壁組織中VIP表達(dá)的影響【摘要】目的:觀察外源性bFGFbasifibrblastgrthfatr對雛雞形覺剝奪性近視眼frdeprivatinypia,FD眼球后壁組織血管活性腸肽vasativeintestinalpeptide,VIP表達(dá)的影響。方法:將出生2d齡的40只來亨雛雞隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，兩組右眼為遮蓋眼，左眼為自身對照眼。對照組遮蓋眼注射1g/L牛血清白蛋白bvinesrualbuin,BSA溶液20L，共10只雞；實(shí)驗(yàn)組遮蓋眼玻璃體腔注射bFGF1，2，4ng+1g/LBSA溶液20L，每種劑量10只雞。1k后采用SP法免疫組織化學(xué)

2、染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響檢測眼球后壁組織VIP的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對照組和實(shí)驗(yàn)組比擬采用單因素方差分析，不同濃度實(shí)驗(yàn)組間采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果:VIP的表達(dá)主要位于視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層和脈絡(luò)膜，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層有較弱表達(dá)。所有組自身對照眼的VIP表達(dá)兩兩比擬均無明顯差異P0.05；實(shí)驗(yàn)組與對照組遮蓋眼相比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，VIP表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組明顯上調(diào)P0.01)，并且VIP的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨藥物劑量增加有逐漸上調(diào)的趨勢P0.05。結(jié)論:外源性bFGF可上調(diào)雞FD眼球后壁組織VIP的表達(dá)。【關(guān)鍵詞】堿性成纖維細(xì)胞生長因子血管活性腸肽形覺剝奪眼外

3、源性TheeffetfexgenusbFGFntheexpressinfvasativeintestinalpeptideinfrdeprivatinypiafhikAbstratAI:Tinvestigatetheexgenusbasifibrblastgrthfatr(bFGF)asaregulatrntheexpressinfvasativeintestinalpeptide(VIP)nfrdeprivatinypia(FD)fhikretinal-hrids-slera.ETHDS:Frtyt-day-ldlehrnhikenseredividedrandlyintntrlgrupan

4、dexperientalgrup.Therighteyesfthehikensereveredandthelefteyesservedastheautntrleyes.TheveredeyesfthentrlgrupreEived20L1g/Lbvinesrualbuin(BSA),10hikensaggregated.TheveredeyesftheexperientalgrupreeivedbFGF(1,2,4ng)+20L1g/LBSA,itheahdsagen10hikens.Theeyesinthetgrupserentinuallyveredfr1eek.Theexpressinf

5、VIPnretinal-hrids-sleraasinvestigatebystreptavidin-perxidase(SP)iunhistheistrystainingandreversetransriptin-plyerasehainreatin(RT-PR).Thedataereanalyzedbyanalysisfvariane(ANVA)beteenthentrlgrupandexperientalgrupandbyanalysisfSNK-qangeahdsageintheexperientalgrup.RESULTS:VIPidespreadexpressinexistednp

6、htreeptr-uter,innernulearlayer,innerplexifrlayerfretinalandhrids;eakexpressinexistednganglinelllayerandnervefiberlayer.TheexpressinfRNAfVIPinautntrleyesbeteengrupsasntstatistiallysignifiant(P0.05).Inparisniththeveredeyesfntrlgrup,theexpressinfRNAfVIPinexperientalgruperesignifiantup-regulated(P0.01),

7、shingadse-dependentanner(P0.05).NLUSIN:ExgenusbFGFuldup-regulatetheexpressinfVIPnretinal-hrids-slerahihayplayanantagnistiatininularenlargeentfhikenFD.KEYRDS:basifibrblastgrthfatr;vasativeintestinalpeptide;frdeprivatinypia;exgenusLiuSZ,JiangJJ,angH.TheeffetfexgenusbFGFntheexpressinfvasativeintestinal

8、peptideinfrdeprivatinypiafhik.IntJphthall(GujiYankeZazhi),2022;7(2):406-4080引言近視的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，因此制約了近視眼的病因?qū)W治療。近年來通過對實(shí)驗(yàn)性近視的研究發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)生物活性物質(zhì)對眼球的生長起重要的調(diào)控作用，其中細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、視黃酸都證實(shí)與近視的發(fā)生、開展有親密的關(guān)系。但是隨著越來越多近視信使的發(fā)現(xiàn)與研究，也提醒了近視的發(fā)病機(jī)制不是一個(gè)簡單的單通路信號傳導(dǎo)過程，而是一個(gè)多種近視信使介導(dǎo)的多通路信號傳導(dǎo)過程，諸多因素間存在著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，因此深化理解各種近視信使之間的互相作用，是否存在協(xié)同或抑制作用，將

9、有助于說明近視的發(fā)病機(jī)制，并找到有效的治療手段。堿性成纖維細(xì)胞因子basifibrblastgrthfatr,bFGF和血管活性腸肽vasativeintestinalpeptide,VIP分屬不同類型的近視信使，我們通過外源性bFGF來觀察其對雞形覺剝奪性近視眼球后壁組織中VIP表達(dá)的影響。1材料和方法1.1材料安康2d來亨雛雞湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧研究所原種雞場提供，雌雄兼用，在購置當(dāng)日，40只雛雞右眼均使用10L塑料試管底制成的眼罩遮蓋，左眼為未遮蓋眼，作為自身對照眼。在12h12h的晝夜節(jié)律下進(jìn)展普通飼養(yǎng)，飼養(yǎng)的動物室通風(fēng)，室溫保持在2832,水和食物隨意。分別向遮蓋眼玻璃體腔注射藥物

10、20L，均以牛血清白蛋白bvinesrualbuin,BSA作為載體，BSA濃度為1g/L。隨機(jī)將這40只雛雞分為對照組玻璃體腔注射1g/LBSA溶液20L和3種劑量梯度的bFGF實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔注射bFGF1，2，4ng+1g/LBSA溶液20L。bFGF(美國Prteh公司)，BSA(美國Siga公司，兔抗人VIP多克隆抗體工作液及SP-9001免疫組化試劑盒美國ZYED公司，trizl、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PR試劑盒美國Ferentas公司。1.2方法雛雞飼養(yǎng)1k后，摘去眼罩，在深麻醉的狀態(tài)下斷頸，無菌快速摘除雙側(cè)眼球，將眼球沿赤道部切開，去除玻璃體，取眼球后壁組織切開一半放入標(biāo)記好的EP管中，

11、于液氮中速凍10s，然后轉(zhuǎn)入-70深低溫冰箱中保存。剩下一半眼球后壁組織投入盛有40g/L多聚甲醛溶液的小瓶中4固定2448h，瓶身貼上膠紙標(biāo)記，石蠟包埋存放，使用時(shí)做5厚連續(xù)切片。免疫組化步驟按ZYED公司SP法操作，以PBS代替一抗做陰性對照，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉積為VIP陽性表達(dá)。另以Trizl常規(guī)提取RNA，用DU-70紫外分光光度計(jì)測量RNA質(zhì)量和濃度，A260/280比值為1.82.0。以10g/L甲醛變性凝膠電泳三條帶顯示明晰來證實(shí)RNA完好。逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA。以DNA為模板，PR擴(kuò)增VIP的目的基因。按照美國生物信息中心NBI提供的基因庫GenBank中查找雛雞VIP的序列序

12、列號：N205366設(shè)計(jì)PR擴(kuò)增引物，使用Prier5軟件設(shè)計(jì)。VIP引物：senseprier5-tagaaatgaaggatgtg-3,anti-sense5-tttgaaagggtgtagtt-3，片段長177bp；-atin引物：senseprier5attttgtgaagta3，anti-sense5atatgtttgagattaaa3，片段長310bp。反響條件為：逆轉(zhuǎn)錄，42溫育60in，94變性5in。PR反響條件為：94變性1in，55退火45s，72延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后先于7210in，再于4保存。反響產(chǎn)物5L加2.5L載樣緩沖液，在2TBE電泳緩沖液中以15g/

13、L瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后攝像，用EagleEye圖像處理系統(tǒng)進(jìn)展分析，VIPRNA的相對含量用VIP與-atin光密度的比值表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果均以表示，數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)展分析，對照組和實(shí)驗(yàn)組比擬采用單因素方差分析，不同濃度實(shí)驗(yàn)組間采用SNK-q檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1眼球后壁組織VIP的表達(dá)對照組和實(shí)驗(yàn)組的遮蓋眼及自身對照眼的眼球后壁組織均有VIP陽性表達(dá)，主要位于視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層和脈絡(luò)膜，可見胞質(zhì)呈棕褐染色，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層有較弱表達(dá)，胞質(zhì)呈淡黃著色圖1。2.2眼球后壁組織VIP的RNA表達(dá)雛雞眼球后壁組織的VIPR

14、NA經(jīng)RT-PR后產(chǎn)生一條177bp的電泳條帶，內(nèi)對照-atin產(chǎn)生一條310bp電泳條帶，對照組和實(shí)驗(yàn)組眼球后壁組織均有VIPRNA表達(dá)；與對照組比擬，實(shí)驗(yàn)組VIPRNA表達(dá)明顯上調(diào)P0.01；VIP的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且隨藥物劑量增加有逐漸上調(diào)的趨勢P0.05；所有組自身對照眼的VIPRNA表達(dá)兩兩比擬均無明顯差異P0.05,圖2，表1。3討論VIP是由28個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，在眼內(nèi)有廣泛分布，結(jié)膜、小梁網(wǎng)、虹膜、脈絡(luò)膜、鞏膜、視網(wǎng)膜都有VIP表達(dá)，葡萄膜存在大量VIP神經(jīng)纖維，即虹膜、睫狀體、睫狀突、視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜都存在VIP神經(jīng)纖維1。有學(xué)者認(rèn)為VIP作為一種重

15、要的近視信使可能在視網(wǎng)膜程度對近視眼后部鞏膜主動重塑起重要的調(diào)控作用2。bFGF屬于多功能成纖維細(xì)胞生長因子家族，作為近視信使的一種，有很多研究都說明采用結(jié)膜下或玻璃體腔注射外源性bFGF可顯著抑制FD所導(dǎo)致的眼軸延長3,4。Rhrer等5對bFGF高親和力和低親和力受體的定位發(fā)現(xiàn)，通過自分泌或旁分泌，幾乎所用的視網(wǎng)膜細(xì)胞都有bFGF和其高親和力受體表達(dá)。在突觸層內(nèi)從狀層和外從狀層，有高、低親和力受體的共同結(jié)合位點(diǎn)，信號傳導(dǎo)需通過高、低親和力受體及bFGF組成的三重復(fù)合體，這種共同性結(jié)合位點(diǎn)位于較窄的突觸層面正是高親和力受體功能維持的基矗在視網(wǎng)膜中VIP通過無長突細(xì)胞分泌，因此在內(nèi)叢狀層有豐富

16、的VIP能無長突細(xì)胞突觸分布，然而這個(gè)部位也正是高、低親和力受體共同結(jié)合位點(diǎn)豐富的層面，bFGF可能通過影響生長調(diào)節(jié)通路無長突細(xì)胞的突觸傳遞活性及效率來調(diào)控多種神經(jīng)遞質(zhì)，也可被這些細(xì)胞所調(diào)控，這種共同的作用可能影響著眼球的生長。本研究就是以bFGF對FD眼中VIP表達(dá)的影響作為切入點(diǎn)，討論bFGF和VIP這兩種近視信使可能存在互相作用。我們發(fā)現(xiàn)，VIP在光感受器外節(jié)有較強(qiáng)表達(dá)，這一表達(dá)部位與一氧化氮合酶iNS在視網(wǎng)膜外層的表達(dá)部位相似6，通常表達(dá)VIP受體的細(xì)胞90顯示有神經(jīng)源性iNS的定位7。bFGF可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生成iNS，通過對一氧化氮生成的調(diào)節(jié)，局部參與光感圖2眼球后壁組織V

17、IPPR產(chǎn)物15g/L瓊脂糖凝膠電泳圖1：自身對照眼；2：對照組遮蓋眼；35:實(shí)驗(yàn)組1,2,4ng遮蓋眼受器的信號轉(zhuǎn)換8。根據(jù)研究結(jié)果，外源性bFGF可能誘導(dǎo)iNS生成，通過一氧化氮生成影響VIP受體活性，從而調(diào)節(jié)VIP的表達(dá)，參與光感受器的信號轉(zhuǎn)換，當(dāng)然這種推測還有待進(jìn)一步證實(shí)，但是由于光感受器外節(jié)是近視信使作用的重要部位，因此這種推測也存在局部理論基矗由于視網(wǎng)膜中VIP通過無長突細(xì)胞分泌，所以在無長突細(xì)胞分布的內(nèi)核層和內(nèi)叢狀層會出現(xiàn)較強(qiáng)VIP表達(dá)，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。由于視網(wǎng)膜VIP的表達(dá)依賴于光條件，在FD大白鼠中可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D50d后，VIP細(xì)胞數(shù)大約減少30，回到正常視覺環(huán)境，VI

18、P免疫活性可完全恢復(fù)9；在亮環(huán)境喂養(yǎng)的鼠，VIP表達(dá)可上調(diào)，而在暗環(huán)境喂養(yǎng)的鼠，幾乎無法檢測到VIP10。本實(shí)驗(yàn)中由于未遮蓋眼承受了正常光的刺激，所以VIPRNA表達(dá)會比對照組要高。承受bFGF玻璃體腔注射的FD眼VIP表達(dá)雖然較未遮蓋眼要低，但是隨著劑量的加大，VIP表達(dá)上調(diào)，這種作用存在劑量依賴性，在高劑量組可發(fā)現(xiàn)VIP表達(dá)與未遮蓋眼相比已沒有差異，bFGF可拮抗FD對VIP免疫活性的抑制，這種現(xiàn)象可能的解釋為大量的外源性bFGF進(jìn)入玻璃體內(nèi)，通過擴(kuò)散作用，到達(dá)視網(wǎng)膜，與所有位于內(nèi)叢狀層的高親和力受體結(jié)合，組成高、低親和力及bFGF三重復(fù)合體，復(fù)合體可通過與VIP能無長突細(xì)胞突觸進(jìn)展信號傳

19、導(dǎo)，對VIP的分泌正性上調(diào)，VIP生成增加。VIP上調(diào)可能影響視網(wǎng)膜內(nèi)層信息傳遞回路，通過復(fù)雜的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜鞏膜調(diào)控機(jī)制，誘導(dǎo)相關(guān)信使最終作用于鞏膜，導(dǎo)致鞏膜主動重塑，因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測VIP可能與bFGF對眼球生長作用起著相拮抗的作用。VIP和bFGF作為近視信使中的兩種，它們之間的關(guān)系并不能解釋整個(gè)近視的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，因此深化理解各種近視信使之間的互相作用，是否存在協(xié)同或抑制作用，將有助于說明近視的發(fā)病機(jī)制，并找到其有效的治療手段。在今后的研究工作中，應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)等根底醫(yī)學(xué)的先進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，重于討論哺乳類和靈長類動物實(shí)驗(yàn)性近視發(fā)生開展中各種近視信使的作用，探索局部近視治療藥物

20、的可行性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Sauelssn-Alen,NilssnSF.Pituiataryadenylateylase-ativatingplypeptide-andVIP-induedativatinfadenylateylaseintheprinenn-pigentediliaryepitheliu:effetfantagnists.JulPharalTher,1999;15(5):389-4002StneRA,LatiesA,RavilaE,ieselTN.Inreaseinretinalvasativeintestinalplypeptideaftereyelidfusininpria

21、tes.PrNatlAadSiUSA,1988;85(1):257-2603RhrerB,StellK.Basifibrblastgrthfatr(bFGF)andtransfringgrthfatrbeta(TGF-beta)atasstpandgsignalstdulatepstnatalulargrthinthehik.ExpEyeRes,1994;58(5):553-5614蔣晶晶,劉雙珍,王華,吳小影,譚星平,夏朝華.外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子對雞形覺剝奪性近視眼的調(diào)控.國際眼科雜志,2022;5(5):936-9385RhrerB,TaJ,StellK.Basifibrblastgrthfatr,itshigh-andl-affinityreeptrs,andthEirrelatinshiptfr-eprivatinypiainthehik.Neursiene,1997;7