再用CTAB溴化十六烷基三甲銨絡(luò)合法進一步精制得銀耳多糖純品并

1、黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院 生物制藥技術(shù)生物分離技術(shù)主講人：張愛華 實訓(xùn)七、銀耳多糖的制備及鑒定 實驗原理 2材料用具 3操作方法 4目的要求 2155注意事項 目的要求了解銀耳多糖制備的基本原理 掌握糖類物質(zhì)提取純化的基本操作技術(shù) 原理 銀耳多糖主要成分為酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五類，不含核酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)。 可利用銀耳子實體經(jīng)水浸泡搗碎，酶浸提，乙醇沉析分離可制得銀耳多糖粗品，再用CTAB (溴化十六烷基三甲銨)絡(luò)合法進一步精制得銀耳多糖純品并進行多糖的鑒定。 材料用具 銀耳子實體干品（50g左右） 燒杯 、布氏漏斗、抽濾瓶、分液漏斗、量筒、離心機、恒溫水浴鍋、透

2、析袋 、濾紙、組織搗碎機、不銹鋼鍋。試劑 （1）1復(fù)合酶制劑(含果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶食品級復(fù)合酶)；（2）2溴化十六烷基三甲銨（CTAB）配制：取2 g CTAB溶于100 mL蒸餾水中，搖勻備用；（3）-萘酚配制：-萘酚5g溶于95乙（4） 5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2molL的氫氧化鈉溶液；（6）0.5甲苯胺乙醇溶液； （7）2molL氯化鈉溶液；（8）2molL鹽酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1融菌酶制劑；（11）無水乙醇；（12）濃硫酸； （13）乙醚。操作方法1.銀耳預(yù)處理 20 g銹鋼鍋中 加水1600 mL 2025浸泡30min 搗碎機中搗碎 銀耳漿液 操

3、作方法2molL鹽酸溶液調(diào)pH至6.3 加入1復(fù)合酶制劑 50下酶促反應(yīng)40min 銀耳漿液 2.酶浸提 80滅酶，保溫浸提約1.5h 80水浴濃縮 操作方法等體積5三氯乙酸-正丁醇溶液 搖勻 離心（3000r/min）15 min 濃縮液 3.多糖的沉淀（有機酸除雜） 下層清液備用 吸去上層正丁醇中層變性蛋白 操作方法2molL的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7 搖勻 抽濾 3.多糖的沉淀（脫色、透析 ） 下層清液備用 加1活性炭80加熱15 min脫色 濾液扎袋流水透析12h 80水浴濃縮抽濾 操作方法加3倍量95乙醇 搖勻 3.多糖的沉淀（乙醇沉析 ） 抽濾液離心（3000r/min）15min

4、沉淀用無水乙醇洗2次 乙醚洗滌1次 50以下真空干燥 操作方法4.精制（一） 取粗品1 g 溶于100 mL水中 攪拌靜置2h2 CTAB 濾液 離心除不溶物60解離4 h 離心3000r/min15 min80熱水洗 氯化鈉 2molL溶液100 mL 操作方法4.精制（二） 解離液加三倍量95乙醇 透析液80濃縮 離心3000r/min15 min精品銀耳多糖 離心3000r/min15 min沉淀用無水乙醇、乙醚洗滌 上清液流水透析10h 50真空干燥 操作方法5.多糖的鑒定（一） 觀察硫酸層與糖溶液界面處顏色變化 透析液1 mL -萘酚溶液2滴 顏色變化搖勻 沿管壁緩加入濃硫酸1.5 mL(勿振動)操作方法5.多糖的鑒定（二） 透析濃縮透析濃縮2 mL 點于濾紙 0.5甲苯胺乙醇溶液染色 加入2CTAB溶液24滴 觀察現(xiàn)象 注意事項1.酶促反應(yīng)的時間、溫度應(yīng)控制好。 2.在制備全流程中應(yīng)時刻注意溫度， 不能超過80