生物化學(xué)A（上）7-蛋白質(zhì)化學(xué)5-結(jié)構(gòu)與功能及研究方法

1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為什么研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的深層次理解對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的基礎(chǔ)對蛋白質(zhì)功能的控制“隨心所欲”創(chuàng)造具有新功能的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與其構(gòu)象及功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團(tuán)形成的次級鍵來維持，可根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)自然折疊和盤曲，形成一定的空間構(gòu)象。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個(gè)分子中發(fā)生一個(gè)殘基的異常，那么該蛋白質(zhì)的功能也會(huì)受到明顯的影響。被稱之為“分子病”的鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血僅僅是574個(gè)氨基酸殘基中，一個(gè)氨基酸殘基(亞基N端的第6號G

2、lu殘基)發(fā)生了變異所造成的，這種變異來源于基因上遺傳信息的突變。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系由較短肽鏈組成的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)不同，生物功能也不同.由較長肽鏈組成的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中，其中“關(guān)鍵”部分結(jié)構(gòu)相同，其功能也相同；“關(guān)鍵”部分改變，其功能也隨之改變。一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定空間構(gòu)象，即一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。只有具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才能表現(xiàn)生物學(xué)功能。實(shí)際上很多蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的惟一因素。除一級結(jié)構(gòu)、溶液環(huán)境外，大多數(shù)蛋白質(zhì)的正確折疊還需要其他分子的幫助。這些參與新生肽折疊的分子，一類是分子伴侶，另一類是折疊酶。一級結(jié)構(gòu)是功能的基

3、礎(chǔ) 一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象和功能也相似。相似的一級結(jié)構(gòu)具有相似的功能，不同的結(jié)構(gòu)具有不同的功能，即一級結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化 從蛋白質(zhì)氨基酸的序列可以了解到重要的生物進(jìn)化信息。對于不同種屬來源的同種蛋白質(zhì)進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)測定和比較，發(fā)現(xiàn)存在種屬差異。蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能，功能不同的蛋白質(zhì)總是有不同的序列。若一級結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)生變化。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與分子病 蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變可以引起疾病，人類有很多種分子病已被查明是某種蛋白質(zhì)缺乏或異常。這些缺損的蛋白質(zhì)可能僅僅有一個(gè)氨基酸異常-分子病。同源蛋白質(zhì)(不同生物中行使相同或相似

4、功能的蛋白質(zhì)）一級結(jié)構(gòu)的種屬差異性 細(xì)胞色素C是真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)，在生物氧化中起傳遞電子的作用。通過數(shù)百種生物的細(xì)胞色素C一級結(jié)構(gòu)的研究表明： （1）親緣關(guān)系越近，AA順序的同源性（相似性）越大。 不同生物與人的細(xì)胞色素C相比較，AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 雞、火雞 13 牛豬羊 10 海龜 15 狗驢 11 小麥 35 粗糙鏈孢霉43 酵母菌 44 （2）盡管不同生物間親緣關(guān)系差別很大，但與細(xì)胞色素C功能密切相關(guān)的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變。肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（1）肌紅蛋白的功能：哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)存氧并運(yùn)輸氧的蛋白。（2）肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1963年，Ken

5、drew）： a .一條多肽鏈，153個(gè)氨基酸殘基，一個(gè)血紅素輔基，分子量17600。 b.肌紅蛋白的整個(gè)分子具有外圓中空的不對稱結(jié)構(gòu)，肽鏈共折疊成8段-螺旋體（A-H），最長的有23個(gè)氨基酸殘基，最短的有7個(gè)氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。 c.具有極性側(cè)鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基多分布于分子內(nèi)部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅素（鐵卟啉 ）輔基的結(jié)構(gòu)及其氧合部位肌紅蛋白的氧合曲線 Y=Mbo2Mbo2+Mb(Y代表在給定的氧壓下肌紅蛋白的氧飽和度) Y=PO2K+PO2（1）（2）由（1）可見：Y=1時(shí)，表明所有肌紅蛋

6、白的氧合位置均被占據(jù)，即肌紅蛋白為氧飽和。由（2）可見： Y=0.5時(shí)，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=K 解離常數(shù)為肌紅蛋白一半被飽和時(shí)的氧壓。Po2Y1.00.510 20 30 40 50血紅蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及鐮刀形貧血病（1）血紅蛋白的功能：存在動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中，具有運(yùn)輸O2和CO2的功能；血紅蛋白還能和H+結(jié)合，從而可以維持體內(nèi)pH。（2）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：a. 四個(gè)亞基的寡聚蛋白，574個(gè)AA殘基，分子量65000；b. 成人的血紅蛋白為22；c. 鏈由141 AA殘基組成， 鏈由146 AA殘基組成。 四個(gè)肽鏈的三級結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白相似，各自內(nèi)部有一個(gè)血紅素輔基。血紅蛋白含有四條

7、肽鏈，每一條肽鏈各與一個(gè)血紅素相連接。血紅素同肽鏈的連接是血紅素的Fe原子以配價(jià)鍵與肽鏈分子中的組氨酸咪唑基的氮原子相連。血紅蛋白（Hemoglobin, Hb) Hb (Mr 64500)幾乎呈球形(d=5.5 nm)，四聚體，血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)顯示了不同亞基間強(qiáng)的相互作用。11界面 (22) 間存在強(qiáng)相互作用，即使用尿素處理，得到的是完整的二聚體，界面間是明顯的疏水作用，但也存在許多氫鍵和一些離子對作用。結(jié)合氧后引起結(jié)構(gòu)改變 血紅蛋白有兩個(gè)主要的構(gòu)象：R態(tài)(relaxed)和T態(tài)(tense)，氧可以與兩種狀態(tài)結(jié)合，但對R態(tài)的親和力更大。無氧結(jié)合時(shí)，T態(tài)更穩(wěn)定，表現(xiàn)出去氧血紅蛋白的主要的構(gòu)

8、象。T態(tài)因更多的離子對作用更為穩(wěn)定，其中的多數(shù)存在于12（及 21)界面間。氧與Hb一個(gè)亞基的T態(tài)結(jié)合，引起構(gòu)象改變?yōu)镽態(tài)，當(dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生這樣的構(gòu)象改變，單個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)幾乎沒有改變。但亞基對相互滑動(dòng)和旋轉(zhuǎn)，使得亞基間的口袋變窄。這一過程中，穩(wěn)定T構(gòu)象的一些離子對被打破，同時(shí)產(chǎn)生一些新的離子對。去氧血紅蛋白的T狀態(tài)TR轉(zhuǎn)變。帶正電荷的側(cè)鏈（藍(lán)色）和帶負(fù)電荷的側(cè)鏈（粉紅色）形成離子對。每個(gè)亞基的Lys C5和每個(gè)亞基的Asp FG1能夠看到，未作標(biāo)記。與氧結(jié)合時(shí)血紅蛋白的變構(gòu)過程1.血紅素中鐵原子的變化 高自旋狀態(tài) 低自旋（非氧合，原子半徑較大） （氧合，原子半徑較?。┙Y(jié)合氧的血紅素附近的構(gòu)象變

9、化。Max Perutz假定TR的轉(zhuǎn)變是由于血紅素周圍幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸側(cè)鏈位置的改變所引起的。T態(tài)的血紅素輕微皺褶，引起血紅素鐵突出His的側(cè)鏈。氧的結(jié)合引起血紅素呈現(xiàn)更平坦的構(gòu)象，將His側(cè)鏈改變而接觸F螺旋。2.亞基三級結(jié)構(gòu)及整個(gè)蛋白四級結(jié)構(gòu)的變化鐵原子的位移 F8His的位移 使F螺旋、EF拐角及FG拐角發(fā)生位移 F 螺旋向H螺旋移動(dòng) 氫鍵斷裂 導(dǎo)致四級結(jié)構(gòu)的鹽橋破壞 擠出BPG分子。脫氧血紅蛋白與氧合血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變 T R緊張態(tài) 松弛態(tài)構(gòu)象緊密 構(gòu)象松弛氧親和力低 氧親和力高血紅蛋白的變構(gòu)別構(gòu)蛋白：蛋白質(zhì)分子中不止有一個(gè)配基的結(jié)合部位（活性部位），還有別的配基的結(jié)合部位（別構(gòu)部位）。

10、別構(gòu)蛋白都有別構(gòu)效應(yīng)。別構(gòu)效應(yīng)：蛋白質(zhì)與配基結(jié)合后改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的生物活性的現(xiàn)象。別構(gòu)蛋白一般都是寡聚蛋白質(zhì)。O2HbHb- O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動(dòng)肌肉毛細(xì)血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血紅蛋白輸氧功能和構(gòu)象變化S形（協(xié)同）結(jié)合曲線?？梢钥闯煞从车陀H和與高親和狀態(tài)轉(zhuǎn)變的雜合曲線。表明血紅蛋白在組織和肺之間對氧濃度微小差異更為敏感，使得血紅蛋白在高氧分壓的肺中能夠結(jié)合氧，在低分壓的組織釋放出氧。pH對氧與血紅蛋白結(jié)合的影響。肺中血液的pH為7.6，組織的血液pH為7.2，實(shí)驗(yàn)測定血紅蛋白與氧

11、的結(jié)合在pH7.4。H+、CO2和BPG 對血紅蛋白結(jié)合氧的影響氧親和力：指血紅蛋白對于氧的結(jié)合牢固程度。（在一定氧分壓下，氧親和力越高，即氧結(jié)合越牢固。相反，氧親和力越低，組織就能得到更多的氧供應(yīng)）H+、CO2的影響：1914年，C. Bohr發(fā)現(xiàn)，高濃度的H+和CO2促使氧合血紅蛋白分子釋放O2，而高濃度的O2促使脫氧血紅蛋白分子釋放H+和CO2血紅蛋白對O2、 H+和CO2結(jié)合的這種相互關(guān)系叫波耳效應(yīng)。HbO2 +H+ +CO2HbH+CO2+ O2肌肉pH7.2肺泡pH7.6波耳效應(yīng)的生理意義BPG的影響：BPG和O2對血紅蛋白的結(jié)合是排斥的BPG降低血紅蛋白親氧能力的重要生理意義：

12、BPG是紅細(xì)胞中存在的糖代謝中間產(chǎn)物。當(dāng)血液流經(jīng)O2分壓較低的組織時(shí)，紅細(xì)胞中的BPG可促進(jìn)氧合血紅蛋白釋放氧，以滿足組織對O2需要。 BPG濃度越大， O2的釋放量越多。紅細(xì)胞中BPG濃度的變化是調(diào)節(jié)血紅蛋白對氧親和力的重要因素。實(shí)例：在高山上；肺氣腫病人；儲(chǔ)藏血液。Po2Y1.0 0.5有BPG氧與血紅蛋白的結(jié)合受2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的調(diào)控 2,3-二磷酸甘油酸(BPG)與Hb的作用表現(xiàn)為一種向異性的變構(gòu)調(diào)控行為。紅細(xì)胞中BPG的濃度相對較高。BPG能大大降低Hb對氧的親和力。 HbBPG + O2 HbO2 + BPG BPG結(jié)合Hb的位點(diǎn)與氧的不同，可以調(diào)控肺中與氧分壓相關(guān)的

13、氧與Hb的親和力。高緯度時(shí)，BPG對于較低氧分壓的生理適應(yīng)起著重要作用。健康人體在海面上能釋放40%的氧進(jìn)入組織，如果被迅速轉(zhuǎn)移到4500米的山上(pO2低)，其向組織釋放氧的能力降低。幾個(gè)小時(shí)后血液BPG的濃度上升，降低Hb與氧的親和力，這種調(diào)節(jié)對于肺中氧的結(jié)合影響不大，但對組織中氧的釋放影響很大，可以恢復(fù)釋放血液攜帶氧的40%進(jìn)入組織。正常人位于海平面時(shí)血液中的BPG約為5 mM，高緯度時(shí)約為8 mM。BPG與去氧血紅蛋白的結(jié)合。BPG的結(jié)合穩(wěn)定去氧Hb的T態(tài)(a)，BPG所帶負(fù)電荷與T態(tài)亞基口袋周圍的正電荷側(cè)鏈作用(b)，由于氧的結(jié)合，T態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)，BPG結(jié)合的口袋消失(c)。煤氣中毒

14、的機(jī)制一氧化碳（CO）也能與血紅素Fe原子結(jié)合。由于CO與血紅蛋白結(jié)合的能力是O2的200倍，因此，人體吸入少量的CO即可完全抑制血紅蛋白與O2的結(jié)合，從而造成缺氧死亡。急救方法是盡快將病人轉(zhuǎn)移到富含O2的環(huán)境中（如新鮮空氣、純氧氣或高壓氧氣），使與血紅素結(jié)合的CO被O2置換出來。血紅蛋白分子病Molecular Disease of Hemoglobin有時(shí)候蛋白質(zhì)上的一個(gè)點(diǎn)突變會(huì)造成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的巨大影響鐮刀狀細(xì)胞貧血?。⊿ickle-Cell Anemia）基因變異直接影響蛋白質(zhì)特性，表現(xiàn)出不同遺傳性狀。例如人的鐮形紅血球貧血癥。紅血球碟形 HbAHbS突變HbC 紅血球鐮刀形血紅

15、蛋白分子有四條多肽鏈： 兩條鏈(141個(gè)氨基酸/條)； 兩條鏈(146個(gè)氨基酸/條)。 HbA、Hbs 、Hbc氨基酸組成的差異在于鏈上第6位上氨基酸（亞基完全相同）：HbA第6位為谷氨酸（GAA、GAG)；HbS第6位為纈氨酸（GUA、GUG)；HbC 第6位為賴氨酸（AAA、AAG）由于鏈一個(gè)氨基酸的突變（6Glu6Val），去氧血紅蛋白S的表面換成了一個(gè)疏水側(cè)鏈，進(jìn)一步引起分子發(fā)生線性締合，形成長鏈，多條長鏈進(jìn)一步聚集成多股螺旋的不溶性纖維。HbS與HbA的四級結(jié)構(gòu)差別不大，但在低氧（脫氧）時(shí)，HbS的溶解度急劇下降（為正常脫氧Hb的1/25）。產(chǎn)生貧血癥的原因：單個(gè)堿基的突變引起氨基酸

16、的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，直接產(chǎn)生性狀變化。正常碟形紅血球轉(zhuǎn)變?yōu)殓牭缎渭t血球缺氧時(shí)表現(xiàn)貧血癥。 HbAHbS HbC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其研究方法1、研究方法2、免疫體系中分子間的識別機(jī)制3、DNA與蛋白質(zhì)的相互作用4、蛋白水解酶與疾病5、膜蛋白、受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)6、酶抑制劑與藥物開發(fā) 7、新技術(shù)與新方法 X-Ray衍射NMR (核磁共振)Molecular Modeling (Simulation)Mutation/Function (分子生物學(xué))結(jié)晶困難分子量不能太大理論不太完善費(fèi)時(shí)費(fèi)力免疫體系分子的識別機(jī)制Helper T cell-免疫體系的關(guān)鍵細(xì)胞 輔助T細(xì)胞巨噬細(xì)胞：吞噬抗原

17、-加工抗原-遞呈給休止的輔助T細(xì)胞-輔助T細(xì)胞被活化-（1）激活免疫系統(tǒng)攻擊已識別的抗原；（2）增生B細(xì)胞；（3）增生殺傷T細(xì)胞MHC IIKiller T Cell-保衛(wèi)我們的主要戰(zhàn)士殺傷T細(xì)胞對抗入侵細(xì)胞的衛(wèi)士，但必須激活，首先要識別和結(jié)合特定的抗原片段-遞呈抗原-MHC I-激活的殺傷T細(xì)胞進(jìn)攻帶有識別抗原的病毒并消滅之。MHC I兩種T細(xì)胞上的MHC分子是特異性識別的關(guān)鍵主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)早期從組織器官移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，也是當(dāng)今免疫遺傳學(xué)的主要內(nèi)容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動(dòng)物不同個(gè)體間進(jìn)行皮膚移植時(shí)出現(xiàn)的排斥反應(yīng)

18、，具有記憶性、特異性和可轉(zhuǎn)移性等免疫反應(yīng)的基本特征，故從廿世紀(jì)40年代起就確認(rèn)移植排斥反應(yīng)是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反應(yīng)的抗原稱移植抗原(transplantation antigen)或組織相容性抗原(histocompatibility antigen)。此等抗原存在于細(xì)胞表面，無器官特異性，不同個(gè)體間其抗原特異性互不相同，但同卵雙生及純系動(dòng)物不同個(gè)體之間，其抗原特異性完全一致。 類分子構(gòu)槽(A)和類分子構(gòu)槽(B)示意圖 人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。 HLA I類分子HLA II類分子MHC I類抗原分子頂部1和2區(qū)組成的抗原肽結(jié)合區(qū)呈溝槽

19、狀結(jié)構(gòu)，1和2區(qū)各含4股片層和1個(gè)螺旋，呈對稱排列而連接成一個(gè)溝槽，片層組成槽底，其兩側(cè)由螺旋組成。溝槽大小為2.5 nm1.0 nm1.1 nm，可容納8-12個(gè)氨基酸殘基組成的短肽。溝槽內(nèi)氨基酸變化大，是類抗原多態(tài)性的基礎(chǔ)。雖然抗原肽與類分子的結(jié)合有一定的選擇性，但并不像抗原與抗體那樣高度特異地結(jié)合，只要被結(jié)合的多肽有2-3個(gè)關(guān)鍵的氨基酸能恰當(dāng)?shù)剡B接到溝槽內(nèi)的多肽結(jié)合基序(binding motif)的相應(yīng)位置上，多肽即可與之結(jié)合，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面遞呈給T細(xì)胞。所以每個(gè)類抗原分子能與一定廣度的多肽譜結(jié)合。鏈由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)可進(jìn)一步分為1、2和3 三個(gè)功能區(qū)?？缒^(qū)含疏

20、水性氨基酸，排列成螺旋跨越脂質(zhì)雙分子層。胞內(nèi)的氨基酸被磷?；笥欣诩?xì)胞外信息向胞內(nèi)傳遞。2m無同種特異性，與3功能區(qū)連接，其功能為有助于類抗原的表達(dá)和穩(wěn)定性。MHC1分子的結(jié)構(gòu)容納抗原的口袋MHC II，1和1區(qū)各自盤繞成一個(gè)螺旋和片層構(gòu)成溝槽的一個(gè)側(cè)壁和半個(gè)底面。由于它的末端是開放的，故可容納較長的多肽(約12-20個(gè)氨基酸)。該溝槽與多肽結(jié)合的特點(diǎn)基本上與類抗原相似，但被結(jié)合的多肽一般來自外源性抗原經(jīng)加工處理降解的產(chǎn)物。 類抗原是由類基因編碼的鏈(34kD)和鏈(29kD)非共價(jià)連接的糖蛋白。鏈和鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別合成后，很快與第3條鏈鏈(或稱Ii鏈)結(jié)合成復(fù)合體，當(dāng)復(fù)合體到達(dá)（內(nèi)體/溶酶體

21、樣結(jié)構(gòu))，鏈解離、降解。鏈的存在，使、鏈不能與其他胞內(nèi)蛋白結(jié)合，并協(xié)助復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到MHC，使之與抗原結(jié)合。鏈和鏈，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)各含兩個(gè)功能區(qū)1、2和、2 蛋白質(zhì)與DNA的相互作用Helix-Turn-Helix (HTH)Helix-Loop-Helix (HLH)Zinc-fingerLeucine zipper非特異性:特異性:HistonesDNA-蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)鍵1、氫鍵:具有識別功能蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側(cè)緣的T-CH3基團(tuán)是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側(cè)鏈相互作用。3、離子鍵：蛋白質(zhì)的帶電的氨基酸殘基的側(cè)鏈與

22、DNA分子上的帶電基團(tuán)形成離子鍵。組蛋白(Histone) 組蛋白（與DNA非特異性結(jié)合） 組蛋白帶正電荷，含Arg、Lys，堿性蛋白，含量恒定，真核細(xì)胞中組蛋白共有5種，分為兩類：一類是高度保守的核心組蛋白（core histone）包括H2A、H2B、H3、H4四種；另一類是可變的連接組蛋白（linker histone）即H1。 核心組蛋白的結(jié)構(gòu)非常保守，特別是H4，牛和豌豆H4的102個(gè)氨基酸中僅有2個(gè)不同。核心組蛋白高度保守的原因可能有兩個(gè)：其一是核心組蛋白中絕大多數(shù)氨基酸都與DNA或其它組蛋白相互作用，可置換而不引起致命變異的氨基酸殘基很少；其二是在所有的生物中與組蛋白相互作用的D

23、NA磷酸二酯骨架都是一樣的。四種核心組蛋白通過C端疏水的氨基酸相互結(jié)合，N端帶正電荷的氨基酸向外伸出，與DNA分子結(jié)合，使DNA分子纏繞在組蛋白核心周圍，形成核小體。尾部含有大量Lys和Arg殘基，為組蛋白翻譯后進(jìn)行修飾的部位，如乙?；?、甲基化、磷酸化等。 H1不僅具有屬特異性，而且還有組織特異性，所以H1是多樣性的。核小體的結(jié)構(gòu)要點(diǎn) 每個(gè)核小體單位包括約200 bp的DNA、一個(gè)組蛋白核心和一個(gè)H1。 由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構(gòu)成盤狀核心顆粒； H3、H4形成4聚體，位于顆粒中央； H2A、H2B二聚體分別位于兩側(cè)。 DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80

24、bp，共1.75圈，約146 bp，兩端被H1鎖合， H1 結(jié)合20bp DNA. 相鄰核心顆粒之間為一段60 bp的連接線DNA (linker DNA)，典型長度60 bp。 組蛋白與DNA是非特異性結(jié)合，核小體具有自組裝性質(zhì)。非組蛋白 非組蛋白是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，又稱序列特異性DNA結(jié)合蛋白（凝膠遲滯電泳實(shí)驗(yàn)）。包括多種參與核酸代謝與修飾的酶類、核質(zhì)蛋白、骨架蛋白、基因表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白等。（1）非組蛋白的特性 含有較多的Asp和Glu，酸性蛋白質(zhì)；整個(gè)細(xì)胞周期都進(jìn)行合成，不象組蛋白只在S期合成，并與DNA復(fù)制同步進(jìn)行；能識別特異的DNA序列，識別信息存在于DN

25、A本身，位點(diǎn)在大溝部分，識別與結(jié)合靠氫鍵和離子鍵；具有多樣性和異質(zhì)性；具有多種功能，如幫助DNA分子折疊，以形成不同的結(jié)構(gòu)域，從而有利于DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄，協(xié)助啟動(dòng)DNA復(fù)制，控制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。（2）序列特異性DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)模式 螺旋-轉(zhuǎn)角- 螺旋模式（HTH) 蛋白質(zhì)形成對稱的同型二聚體，每個(gè)單位由20個(gè)氨基酸的小肽組成，兩個(gè)螺旋相互連接成轉(zhuǎn)角。羧基端的螺旋負(fù)責(zé)識別DNA大溝的特異堿基信息，另一個(gè)螺旋與磷酸戊糖鏈骨架接觸。 鋅指模式 (Zinc Finger) 每個(gè)鋅指單位是一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由30個(gè)左右氨基酸殘基組成，其中一對Cys和一對His與Zn2+形成配位鍵

26、，鋅指的C端形成 螺旋負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合。亮氨酸拉鏈?zhǔn)侥Ｊ?(Leucine Zipper) 蛋白質(zhì)肽鏈的羧基端約35個(gè)氨基酸殘基有形成a螺旋的特點(diǎn)，每兩圈（7個(gè)氨基酸殘基）有一個(gè)Leu殘基。 螺旋一側(cè)的Leu排成一列，兩個(gè)螺旋間靠Leu間的疏水作用力形成一條拉鏈狀結(jié)構(gòu)。HTH Motif最初發(fā)現(xiàn)于噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結(jié)合蛋白中存在。由兩個(gè)較短的螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結(jié)構(gòu)域，HTH通過DNA雙螺旋大溝識別、結(jié)合反向重復(fù)序列TGTG/CACA。蛋白質(zhì)與DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子識別機(jī)制

27、鋅指結(jié)構(gòu)(Zinc Finger Structure) 鋅指結(jié)構(gòu)：基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子存在于致癌基因、果蠅控制發(fā)育的基因、受生長因子和分化信號誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)序列中。 鋅指區(qū)域：由四個(gè)Cys或二個(gè)Cys及二個(gè)His組成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。 鋅指蛋白：213個(gè)手指，各由23氨基酸組成，并由78個(gè)氨基酸連接；與DNA大溝結(jié)合并環(huán)繞DNA分子，大溝與特異DNA堿基相互作用。Zinc-finger蛋白結(jié)構(gòu)特征指狀結(jié)構(gòu)約含23個(gè)氨基酸殘基，鋅以4個(gè)配價(jià)鍵與4個(gè)Cys或2個(gè)Cys和2個(gè)His相結(jié)合。整個(gè)蛋白質(zhì)分子可有2-9個(gè)這樣的鋅指重復(fù)單位。每一個(gè)單位可

28、以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個(gè)核苷酸。如與GC框結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SP1中就有連續(xù)的3個(gè)鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)12 AAs堿性亮氨酸拉鏈 (bZIP)可形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)二聚體的亮氨酸拉鏈 (leucine zipper，LP)；具有35個(gè)氨基酸殘基，其中有4個(gè)亮氨酸，每7個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次，形成-螺旋時(shí)， 每兩圈伸出一個(gè)亮氨酸，由亮氨酸殘基間的疏水作用力形成一條拉鏈，產(chǎn)生蛋白質(zhì)二聚體；堿性-螺旋與DNA磷酸殘基和堿基互作，二聚體剪刀結(jié)構(gòu)。Leucine-zipper的結(jié)構(gòu)特征蛋白質(zhì)分子的肽鏈上每隔6個(gè)氨基酸就有1個(gè)亮氨酸殘基，結(jié)果就導(dǎo)致這些亮氨酸殘基都在螺旋的同一個(gè)方向出

29、現(xiàn)。兩個(gè)相同結(jié)構(gòu)的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結(jié)合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合。若不形成二聚體則對DNA的親和結(jié)合力明顯降低。這類蛋白質(zhì)能夠與CAAT框和病毒增強(qiáng)子結(jié)合。 Leucine Zipper蛋白的剪刀型結(jié)合模式足跡法研究DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)DNA Foot Printing足跡法技術(shù)用于測定與特殊蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)和相應(yīng)的核苷酸順序。如該技術(shù)提供了RNA聚合酶與啟動(dòng)子之間相互作用的信息并確定了作用位點(diǎn)（啟動(dòng)子）的核苷酸順序。研究蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)的Foot Printing由含70RNA多

30、聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動(dòng)子蛋白水解酶與人類疾病Cardiovascular diseases 心血管疾病Hemophilia A/B 血友病Programmed cell death / appotosis 細(xì)胞凋亡Alzheimer disease 癡呆Cancer metastasis 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移Pulmonary emphysema/pancreatitis/arthritis 肺氣腫/胰腺炎/關(guān)節(jié)炎Parasite disease: malaria/T cruzain 瘧疾Influenza A & AIDS 甲型流感與愛滋病細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)有確定的壽命Proteosome是蛋白質(zhì)降

31、解的專業(yè)機(jī)構(gòu)蛋白質(zhì)降解的泛素蛋白酶體途徑 泛素(ubiquitin，Ub)是76個(gè)氨基殘基組成的小分子多肽，可以以共價(jià)結(jié)合的方式與蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基相連。蛋白質(zhì)一旦接有泛素，稱為發(fā)生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的參與下被三種酶依序催化，形成蛋白質(zhì)與一條泛素聚合鏈相結(jié)合的復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)入蛋白酶體，然后降解為肽段。此為生物大分子在胞質(zhì)中降解的泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteosome pathway)。泛素化是一個(gè)具有普遍意義的免疫生物學(xué)現(xiàn)象。蛋白質(zhì)降解的泛素蛋白酶體途徑 蛋白質(zhì)泛素化系統(tǒng)由3個(gè)組分構(gòu)成，一個(gè)稱為泛素激活酶E1，它可利用水解ATP釋放的能量以

32、其 Cys的巰基與泛素C端的Gly形成高能硫酯鍵。然后連接在其上的泛素被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)泛素結(jié)合酶E2上，同時(shí)，被選中的靶蛋白與第三個(gè)組分即靶蛋白泛素連接酶E3結(jié)合。E2然后將與其連接的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，并與靶蛋白 Lys -NH2基團(tuán)形成異肽鍵(isopeptide bond)，E2被釋放。選擇什么樣的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化主要取決于E2和E3。血栓形成（Thrombosis） 活體心臟、血管內(nèi)血液的某些成分析出，凝集形成固體質(zhì)塊的過程稱血栓形成，形成的固體質(zhì)塊叫血栓。內(nèi)膜損傷后血小板粘集，形成血小板小堆；以后內(nèi)源性凝血系統(tǒng)、外源性凝血系統(tǒng)激活，形成纖維蛋白，血小板與纖維蛋白等形成血小板血栓，阻礙血

33、流，血流下游形成漩渦，形成新的血小板血栓，如此往復(fù)形成不規(guī)則梁索狀或珊瑚狀突起，稱為血小板小梁，在小梁間則由網(wǎng)有大量紅細(xì)胞的纖維蛋白網(wǎng)填充。后血栓逐漸增大，阻塞血管，血流停止，血液發(fā)生凝固，形成更大血栓。 血栓形成與消除1. 溶解吸收2. 機(jī)化再通3.軟化脫落栓子栓塞梗死 組織型纖溶酶原激活劑 纖溶酶原激活物抑制物 血纖維蛋白溶酶原 溶纖酶甲型流感病毒與艾滋病毒流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是引起流感的病原體。流感是一種上呼吸道急性傳染病，它傳染性強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高。已引起數(shù)次世界性大流行，僅19181919年的世界大流行，死亡人數(shù)就達(dá)2000萬，對人類的生命健康危害極大。Influ

34、enza Virus流感病毒（Influenza virus）屬正粘液病毒科，流感病毒屬，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原變異性最強(qiáng)，感染人類和其他動(dòng)物，引起中、重度疾病，侵襲所有年齡組人群，常引起世界性大流行。乙型變異性較弱，僅感染人類，一般引起輕微的疾病，主要侵襲兒童，可引起局部爆發(fā)。丙型抗原性比較穩(wěn)定，僅引起嬰幼兒感染和成人散發(fā)病例。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個(gè)亞型（H1H15），N有9個(gè)亞型（N1N9）。其中僅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人類，其它許多亞型的自然宿主是多種禽類和動(dòng)物。其中對禽類危害最大的為H5、H7和H9亞型毒株。 Life Cyc

35、le of Influenza A virusA型流感病毒的H抗原蛋白的結(jié)構(gòu)域受蛋白水解酶活化后才有感染細(xì)胞的能力艾滋病（AIDS)艾滋病的醫(yī)學(xué)全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，縮寫AIDS ）”，其病原為“人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，縮寫HIV）”。HIV專門攻擊人體的T淋巴細(xì)胞，致使人體免疫功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致人體喪失了對各種病原體的抵抗能力而發(fā)生多種機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤和多系統(tǒng)損害的綜合征，最終導(dǎo)致死亡。外界環(huán)境中的生存能力較弱，對物理因素和化學(xué)因素的抵抗能力較低。對熱很敏感，

36、56 處理 30min 可使其在體外對人的 T淋巴細(xì)胞失去感染性，但 不能完全滅活血清中的HIV，100處理20 min可將其完全滅活。除此之外，75%的酒精也可滅活，但紫外線不能滅活。變異強(qiáng)：艾滋病毒的變異性很強(qiáng)，給研制預(yù)防性疫苗和治療性藥物帶來了極大困難。易感性：人群普遍易感，無國界、無季節(jié)性。HIV感染與人類的行為密切相關(guān)，如：多性伴、吸毒等。env：囊膜蛋白（包膜蛋白） gag：核心蛋白Gag：gag基因產(chǎn)生55 kD的蛋白p55，p55由病毒編碼的一個(gè)蛋白酶切成四個(gè)小蛋白：MA（p17基質(zhì)）、CA（p24衣殼）、NC（p9核衣殼）、及p6。 Pol：Gag-Pol融合蛋白由病毒編碼的

37、一個(gè)蛋白酶切為四個(gè)小蛋白：Pro（p10蛋白酶）、RT（p50逆轉(zhuǎn)錄酶）、RNase H（p15 RNA酶H）、及INT（p31整合酶）。Env：Env起先是160 kD的蛋白，在高爾基體中經(jīng)糖基化，在天冬酰胺上被加上25至30個(gè)復(fù)雜的N連糖鏈，成為gp160；這個(gè)糖基化過程對感染性是必要的，之后，宿主細(xì)胞的一個(gè)蛋白酶將gp160切為gp41與gp120。 AIDS病毒生活史有個(gè)必須的Protease癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要蛋白水解酶的幫助組織蛋白酶B可消化層粘連蛋白、纖粘連蛋白、膠原、蛋白聚糖及其他基底膜組分，因此有人推測該酶可能與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。后來在人前列腺癌的侵襲細(xì)胞和毛細(xì)血管中證實(shí)了這一推測

38、。這種酶也許可以作為癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，胃腸道癌癥病人的血清和尿液中酶的含量都高于健康人群。更重要的是肝、肺癌轉(zhuǎn)移的患者該酶的含量高于未轉(zhuǎn)移者。惡性腫瘤切除后可恢復(fù)至正常水平?；啄さ南饔檬鼓[瘤細(xì)胞得以進(jìn)入結(jié)締組織，因此腫瘤細(xì)胞的攻擊性與蛋白水解酶水平呈正相關(guān)不足為奇。膜蛋白、受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6) 細(xì)胞來源: 主要由單核巨噬細(xì)胞、 Th2細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。主要功能（1）刺激活化細(xì)胞增殖，分泌抗體； （2）刺激細(xì)胞增殖及CTL活化；（3）刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)；（4）促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育。白介素-6(Interle

39、ukin-6)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)STAT:signal transducer and activatior of transcription(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子）JAK: janus kinase Acute-phase response factor成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs） 主要來自牛腦和腦垂體的提取液，是大約150 個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)的酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性為20%50% 。其后分離的癌基因產(chǎn)物的細(xì)胞增殖因子與上述FGFs結(jié)構(gòu)類似，也被分類在FGFs家族，并依次命名為FGF3 9。目前已發(fā)現(xiàn)23種 FGFs。 FGFs作為細(xì)胞間信號分

40、子在胚胎發(fā)生和分化過程中起重要作用。FGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)幾條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑什么是生物芯片技術(shù)？以微點(diǎn)陣排列技術(shù)（Microarray Technology）將生物大分子固定到適當(dāng)?shù)墓腆w載體上，方便各種生化和分子生物學(xué)的操作。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（Protein Chips，Protein Array）基本原理：將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析。依據(jù)的雜交反應(yīng)原理:抗原-抗體反應(yīng)配體-受體反應(yīng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)芯片的操作過程1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上；2. 抗體或抗抗體標(biāo)記示

41、蹤；酶：HRPO、AP膠體金熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等3.檢測標(biāo)本中的抗體或抗原。點(diǎn)抗原測抗體點(diǎn)抗原測抗體點(diǎn)抗體測抗體-捕獲法點(diǎn)抗體測抗原蛋白質(zhì)芯片篩選新藥的原理受體、酶的微點(diǎn)陣與中草藥抽提物反應(yīng)后再與受熒光標(biāo)記的配體或底物結(jié)合以激光進(jìn)行檢測不出現(xiàn)熒光的點(diǎn)表明中草藥樣品中含有與這些點(diǎn)上的蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)，因此是作用于這些位點(diǎn)的新藥候補(bǔ)。熒光基因芯片操作程序經(jīng)典的DNA芯片數(shù)據(jù)DNA芯片的操作過程利用半導(dǎo)體技術(shù)的DNA芯片酵母雙雜交(Yeast Two Hybrid) 技術(shù)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是人類基因組計(jì)

42、劃的完成，使人類對基因的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識不斷加深，但基因編碼的蛋白質(zhì)的功能研究尚是一個(gè)難題。酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)。酵母雙雜交的原理利用酵母作為真核蛋白質(zhì)相互作用的模型利用誘餌質(zhì)粒篩選文庫或者單個(gè)已知蛋白通過報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄鑒定蛋白的相互作用使用不同的培養(yǎng)基篩選陽性克隆酵母雙雜交由Fields 等在1989 年提出，是基于對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。GAL4包括兩個(gè)彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域，位于N 端1-

43、174 位氨基酸殘基區(qū)段的DNA 結(jié)合域(DNA-BD)和位于C 端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activation domain，AD)。DNA-BD 能夠識別位于GAL4 效應(yīng)基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS)，并與之結(jié)合。而AD 則是通過與轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)(transcription machinery)中的其他成分之間的結(jié)合作用，以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD單獨(dú)分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活U

44、AS下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交體系UAS: Upstream activating sequence,酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)道基因的表達(dá)探測蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用。主要有二類載體: a. 含DNA -binding domain的載體; b. 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時(shí)， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報(bào)告株中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence, NLS)， 而GAL4-

45、ad沒有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。 另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株，報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞， 酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn): 1 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。2具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易與來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個(gè)蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個(gè)基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad， VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)

46、入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報(bào)道基因表達(dá)(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。 酵母雙雜交模型DNA-BindingDomain誘餌蛋白Bait Protein捕獲（獵物）蛋白Prey ProteinTranscriptionActivatingRegionReporter GeneDNA-Binding Site模 型文庫篩選的步驟將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報(bào)告基因啟動(dòng)子的酵母細(xì)胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母。再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。通過報(bào)告基因的功能篩選相互作用的蛋白。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Transgenic Animals什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 將克隆的外源基因注射到一個(gè)受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn) 入的外