《球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法》編制說明

1、球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法標(biāo)準(zhǔn)方法編制說明書工作簡況項目來源根據(jù)CSTM標(biāo)準(zhǔn)委員會2022年6月6日材試標(biāo)字【2022】089號文件簽發(fā)的關(guān)于CSTM標(biāo)準(zhǔn)的立項公告，批準(zhǔn)CSTM標(biāo)準(zhǔn)球形蛋白質(zhì)表觀分子量的核磁共振檢測方法立項，中文版立項編號為：CSTM LX 9802 00956-2022，英文版立項編號為：CSTM LX 9802 00956-2022 E，標(biāo)準(zhǔn)項目由科學(xué)試驗領(lǐng)域委員會（CSTM/FC98）或技術(shù)委員會（CSTM/FC98/TC02）歸口，由北京大學(xué)分析測試中心負(fù)責(zé)牽頭起草。參與單位及工作組成員主編單位及成員：北京大學(xué)分析測試中心，李紅衛(wèi)博士和扶暉博士。協(xié)作單位

2、及成員：清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心，徐寧博士；深圳灣實驗室公共技術(shù)服務(wù)平臺，吳宇杰博士；布魯克（北京）科技有限公司，呂娟工程師。工作簡要過程2022年3月2日，北京大學(xué)分析測試中心在征求了多個協(xié)作單位同意的情況下，決定牽頭組織制定球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法的標(biāo)準(zhǔn)方法。協(xié)作單位同意由北京大學(xué)分析測試中心負(fù)責(zé)方法的申請工作。2022年3月7日，北京大學(xué)分析測試中心完成了標(biāo)準(zhǔn)草案的預(yù)審稿和項目建議書等文件，北京大學(xué)分析測試中心老師以及各個協(xié)作單位的老師都提出了寶貴的建議。2022年4月29日，立項答辯前夕，北京大學(xué)分析測試中心專門召開CSTM標(biāo)準(zhǔn)制定的工作會議。李紅衛(wèi)老師進(jìn)行了立項答辯

3、的試講，中心其它老師提出了修改意見。2022年5月6日，在CSTM標(biāo)準(zhǔn)委員會的組織下，李紅衛(wèi)代表北京大學(xué)分析測試中心完成了球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法的標(biāo)準(zhǔn)方法的立項答辯。答辯過程中各個專家給出了修改建議。2022年6月6日，CSTM委員會簽發(fā)了正式的立項公告。2022年5月6日，完成立項答辯后，由北京大學(xué)分析測試中心、清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心、深圳灣實驗室公共技術(shù)服務(wù)平臺等單位成員成立了標(biāo)準(zhǔn)編寫工作組，建立了微信工作群，并進(jìn)行了第一次工作組線上會議，正式開始了標(biāo)準(zhǔn)方法的編寫工作。會上北京大學(xué)分析測試中心通報了項目立項情況，工作組確定了標(biāo)準(zhǔn)制定方案和時間安排，并進(jìn)行了工作劃分。北

4、京大學(xué)分析測試中心負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)方法理論文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)制定的調(diào)研工作，完成球形蛋白質(zhì)-表觀分子量測定-核磁共振方法標(biāo)準(zhǔn)草案和標(biāo)準(zhǔn)編制說明的起草工作，并負(fù)責(zé)設(shè)計試驗方案和匯總整理試驗結(jié)果等工作。清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心和深圳灣實驗室公共技術(shù)服務(wù)平臺負(fù)責(zé)設(shè)計和完成方法準(zhǔn)確性驗證試驗及方法準(zhǔn)確度的相關(guān)工作。布魯克（北京）科技有限公司負(fù)責(zé)試驗儀器軟硬件保障及相關(guān)試驗參數(shù)校驗等工作。2022年5月23日標(biāo)準(zhǔn)編寫工作組線上召開了第二次會議，對北京大學(xué)分析測試中心提供的標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了討論和修改，進(jìn)一步完善了標(biāo)準(zhǔn)草案，并確定了測試試驗與驗證試驗的試驗方案與試驗參數(shù)。2022年6月30日、7月7日和7月8日，北京大學(xué)分

5、析測試中心、清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心和深圳灣實驗室公共技術(shù)服務(wù)平臺分別完成了測試實驗和驗證實驗數(shù)據(jù)的采集與處理。2022年7月15日北京大學(xué)分析測試中心完成了光散射驗證數(shù)據(jù)的采集與處理。2022年7月18日北京大學(xué)分析測試中心完成了數(shù)據(jù)的匯總與精密度分析，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)草案的完善和標(biāo)準(zhǔn)編制說明草案的編寫。2022年7月21日，標(biāo)準(zhǔn)工作組召開第三次線上工作會議，對北京大學(xué)分析測試中心提供的標(biāo)準(zhǔn)草案和標(biāo)準(zhǔn)編制說明草案進(jìn)行了討論和修改，形成了標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李紅衛(wèi)，扶暉，徐寧，吳宇杰，呂娟。標(biāo)準(zhǔn)化對象簡要情況及制訂標(biāo)準(zhǔn)的原則標(biāo)準(zhǔn)化對象簡要情況蛋白質(zhì)溶液體系中的表觀分子量更加真實的反

6、映了蛋白質(zhì)在接近生理狀態(tài)下的聚集狀態(tài)，而該聚集狀態(tài)與許多蛋白質(zhì)的功能直接相關(guān)，也是導(dǎo)致一些疾病的直接原因。核磁共振脈沖梯度場擴(kuò)散序譜實驗可以測定溶液體系中化合物的擴(kuò)散系數(shù)，進(jìn)而得到分子在溶液條件下的表觀分子量，從而研究分子在溶液中的聚集狀態(tài)。對于蛋白質(zhì)來說，其研究多在緩沖體系中完成，蛋白質(zhì)的緩沖體系多種多樣，緩沖體系的不同直接影響溶液的粘度從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散系數(shù)發(fā)生改變，得到的表觀分子量也不同。并且由于蛋白質(zhì)分子量較大，蛋白質(zhì)濃度不同也將改變?nèi)芤旱恼扯?，引起擴(kuò)散系數(shù)改變從而影響表觀分子量的測定。并且在實際測定過程中，不同的儀器脈沖梯度場強(qiáng)度也存在一些誤差，而此誤差將會以平方的形式放大作用于

7、擬合的擴(kuò)散系數(shù)，從而導(dǎo)致測定結(jié)果的差別。因此在不同的測試條件下得到可比的數(shù)據(jù)是非常困難的。標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性在不同測試條件下測得的表觀分子量不能直接進(jìn)行比較，大大降低了已測定的表觀分子量在不同蛋白質(zhì)體系中的應(yīng)用價值。因此建立一套標(biāo)準(zhǔn)的測試方法，使得不同實驗室、不同儀器和不同樣品條件測定的結(jié)果具有可比性可以提高數(shù)據(jù)結(jié)果的使用率，提高測試效率。并且，蛋白質(zhì)表觀分子量與蛋白質(zhì)的功能息息相關(guān)，建立一套標(biāo)準(zhǔn)的測試方法在蛋白質(zhì)的功能研究，以及蛋白質(zhì)類藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制中均有較好的應(yīng)用前景。制訂標(biāo)準(zhǔn)的原則2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)的編寫格式按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)

8、和編寫規(guī)則、GB/T 20001.4 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一規(guī)定和要求的統(tǒng)一規(guī)定和要求進(jìn)行編寫。2.3.2 本標(biāo)準(zhǔn)以建議一套在不同實驗條件下結(jié)果具有普適性的標(biāo)準(zhǔn)化球形蛋白質(zhì)表觀分子量的測定方法為原則。方法中通過加入內(nèi)標(biāo)，以核磁共振測定相對擴(kuò)散系數(shù)代替擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)行表觀分子量的測定，有效降低了測定條件對實驗結(jié)果的影響，使得即使不同實驗室的結(jié)果依然具有可比性，這是現(xiàn)有的方法無法實現(xiàn)的。2.3.3 本標(biāo)準(zhǔn)以北京大學(xué)分析測試中心李紅衛(wèi)博士2018發(fā)表的新方法的論文為基礎(chǔ)，旨在探索一條針對“高精尖”儀器設(shè)備新技術(shù)方法“實驗室研發(fā)-實驗室應(yīng)用-形成標(biāo)準(zhǔn)方法-廣泛工業(yè)應(yīng)用”的科技成果轉(zhuǎn)化途

9、徑。此類設(shè)備對操作人員技術(shù)水平要求較高，更多的時候是使用已經(jīng)具有的技術(shù)方法為科學(xué)研究提供服務(wù)。針對此類設(shè)備新技術(shù)的開發(fā)對操作人員技術(shù)水平要求更高，更加難以實現(xiàn)，而研發(fā)新方法后再進(jìn)行科技成果轉(zhuǎn)化的更少。采用國內(nèi)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)情況本標(biāo)準(zhǔn)為創(chuàng)新方法，在制定過程中未采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容確定的論據(jù)概述標(biāo)準(zhǔn)起草人對國內(nèi)外檢測蛋白質(zhì)表觀分子量的檢測技術(shù)以及應(yīng)用環(huán)境進(jìn)行了調(diào)研，目前還沒有發(fā)現(xiàn)能夠測定蛋白質(zhì)表觀分子量的標(biāo)準(zhǔn)，而蛋白質(zhì)表觀分子量更加真實的反映了蛋白質(zhì)在接近生理狀態(tài)下的聚集狀態(tài)，該聚集狀態(tài)與許多蛋白質(zhì)的功能直接相關(guān)，也是導(dǎo)致一些疾病的直接原因，在科研與醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。在解

10、決了不同測試環(huán)境影響下，核磁共振技術(shù)是測定蛋白質(zhì)在各種體系下表觀分子量最有效的手段之一。因此標(biāo)準(zhǔn)起草人編制了球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法標(biāo)準(zhǔn)方法草案，主要包括范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理和精密度等內(nèi)容。標(biāo)準(zhǔn)名稱本標(biāo)準(zhǔn)在立項時的名稱為球形蛋白質(zhì)表觀分子量的核磁共振檢測方法，根據(jù)立項時專家的建議，在編制過程中標(biāo)準(zhǔn)編寫工作組決定采用符合GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則要求的三段式寫法，將標(biāo)準(zhǔn)名稱變更為球形蛋白質(zhì)-表觀分子量檢測-核磁共振方法，相應(yīng)的英文名稱并更為Globular Prot

11、ein - Determination of Apparent Molecular Weight - NMR Method。范圍關(guān)于測定對象的分子形狀：實際使用過程中球形和近球形的蛋白質(zhì)分子均適用于本標(biāo)準(zhǔn)的方法，大多數(shù)的蛋白質(zhì)均滿足這兩種情況，包括對重組的蛋白質(zhì)類藥物、抗體藥物以及其它用于科研的具有特殊功能的蛋白質(zhì)分子的檢測。此方法也可以應(yīng)用于非球形蛋白質(zhì)的研究，通過對比測定表觀分子量和本身分子量，可以得出非球形蛋白質(zhì)分子性質(zhì)偏離球形的程度。關(guān)于檢測對象分子量：分子量超過100kDa時，蛋白質(zhì)的核磁信號較弱，測定結(jié)果誤差會變大，故限定為100kDa以下的蛋白質(zhì)。如果信號強(qiáng)度足夠，100kDa的

12、限定是可以突破的。關(guān)于檢測對象濃度：標(biāo)準(zhǔn)中使用的內(nèi)標(biāo)和蛋白質(zhì)分子分子量差別較大，體系屬于復(fù)雜體系，復(fù)雜體系在較稀情況下，粘度對兩類分子影響差別不大（見標(biāo)準(zhǔn)原理部分），因此給出了濃度限制，實際上，平時用來測試的蛋白質(zhì)濃度極少會用到1mM以上的濃度，因此絕大多少樣品滿足此條件。關(guān)于蛋白質(zhì)的緩沖體系：緩沖體系中可以不同，這也是這個方法的優(yōu)勢，但是最好不要有更大的分子添加劑，因此更大分子的添加劑會增大粘度對兩類分子的粘度影響（見標(biāo)準(zhǔn)原理部分），實際上常規(guī)測試樣品是極少有大分子添加劑的，因為添加劑會產(chǎn)生信號干擾。原理 幾乎所有的關(guān)于核磁共振測定擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)而測定分子量、分子形狀相關(guān)的文獻(xiàn)都是從Stokes

13、Einstein方程開始，即核磁共振測得的擴(kuò)散系數(shù)通過該方程與分分子形狀進(jìn)而與分子量相關(guān)。最初在編寫標(biāo)準(zhǔn)時原理也是從這方面開始的。但是立項時專家提出如果同時考慮內(nèi)標(biāo)小分子和蛋白質(zhì)大分子的復(fù)雜體系，StokesEinstein方程可能需要修正，由于目前該方法還比較新，建議夯實基礎(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)編寫組覺得這是非常好的建議，進(jìn)一步更深層次的調(diào)研了這方面的文獻(xiàn)，整理后加入了原理部分，使得原理部分更加詳實。儀器、參數(shù)及數(shù)據(jù)擬合 考慮到蛋白質(zhì)大分子信號較弱，所以需要采用高場超低溫探頭來進(jìn)行實驗。蛋白質(zhì)大分子的樣品都是在水的緩沖體系中檢測，相對與水的信號，蛋白質(zhì)的分子的信號是非常非常弱的，所以水峰壓制應(yīng)格外重視，如

14、應(yīng)有好的勻場，準(zhǔn)確的水的化學(xué)位移中心以及準(zhǔn)確刻度的脈沖時間等。由于最終是通過強(qiáng)度的擬合得到擴(kuò)散系數(shù)，所以譜圖應(yīng)保證有足夠的信噪比，同時數(shù)據(jù)處理時要仔細(xì)調(diào)信號相位和基線。擬合使用的是e指數(shù)擬合，最強(qiáng)的信號和最弱的信號在保證信噪比的情況下，要到擬合曲線兩端的平臺區(qū)，否則擬合會有誤差，經(jīng)過工作組的多次實踐，當(dāng)最強(qiáng)信號和最弱信號強(qiáng)度比2030倍時最佳，所以需要對擴(kuò)散時間和梯度場時間進(jìn)行優(yōu)化。精密度和不確定度目前并沒有測定表觀分子量的標(biāo)準(zhǔn)方法，關(guān)于精密度的計算并沒有可用的參考。編寫工作組根據(jù)該方法實際使用的場景，經(jīng)過討論，認(rèn)為同一樣品在不同的實驗條件下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，就能很好的滿足實際使用的需

15、求。實際試驗過程中，由北京大學(xué)分析測試中心、清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心以及深圳灣實驗室公共技術(shù)平臺對同一實驗不同核磁共振儀器以及不同實驗室的核磁共振儀器條件下進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果顯示，無論同一實驗室的不同儀器還是不同實驗室的儀器，實際測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。考慮到本標(biāo)準(zhǔn)的方法還比較新，立項時專家提出的使用更多的方法如質(zhì)譜進(jìn)行對比的問題，經(jīng)過工作組的調(diào)研，質(zhì)譜直接測定的是分子的絕對分子量和我們所提出的考慮溶液條件下的表觀分子量還是有些出入的，但如果驗證實驗中采用的蛋白質(zhì)在溶液中是以穩(wěn)定的單體形式存在，則絕對分子量和表觀分子量是比較接近的，這種情況下質(zhì)譜可以進(jìn)行試驗方法的驗證。工作組選擇了

16、滿足以上條件的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，并且此標(biāo)準(zhǔn)蛋白出廠時已經(jīng)進(jìn)行了質(zhì)譜分子量的測定，故工作組認(rèn)為可以直接使用標(biāo)注分子量驗證，無需再重復(fù)進(jìn)行質(zhì)譜試驗，結(jié)果顯示標(biāo)注分子量與核磁共振結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。另外，光散射可以測定特定溶液條件下的表觀分子量，使用光散射的方法測定的表觀分子量與核磁共振測定結(jié)果的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%。不同的試驗手段都驗證了核磁共振測定表觀分子量的可靠性。主要試驗（或驗證）結(jié)果的分析、綜述報告等 試驗結(jié)果包括核磁共振儀器試驗結(jié)果和其它手段試驗結(jié)果。前者包括同一實驗室、不同核磁共振儀器的試驗結(jié)果和不同實驗室、不同儀器的試驗結(jié)果，這些結(jié)果用于驗證不同儀器和不同操作人結(jié)果的重復(fù)性

17、。同時測定時每個樣品分別在三種不同的緩沖體系下進(jìn)行，測定結(jié)果用于驗證緩沖體系中不同鹽離子濃度和不同粘度對測定結(jié)果的影響。這些實驗結(jié)果都具有較好的重復(fù)性。其它的實驗結(jié)果包括了標(biāo)注分子量（質(zhì)譜結(jié)果）和光散射結(jié)果與核磁共振試驗結(jié)果的對比，用于驗證核磁共振試驗方法的可靠性。結(jié)果顯示核磁共振方法具有較好的可靠性。具體結(jié)果見本標(biāo)準(zhǔn)精密度部分，使用參數(shù)及擬合曲線等見標(biāo)準(zhǔn)附錄部分。與有關(guān)的現(xiàn)行的方針、政策、法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)符合現(xiàn)行方針、政策、法律、法規(guī)的規(guī)定?，F(xiàn)行的JY/T 0578-2020,超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測試方法通則標(biāo)準(zhǔn)中界定術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。對征求意見及重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)（暫無）標(biāo)準(zhǔn)水平建議，預(yù)期的社會經(jīng)濟(jì)效果本標(biāo)準(zhǔn)建立了一套使用核磁共振技術(shù)測定球形或近球形蛋白質(zhì)表觀分子量的標(biāo)準(zhǔn)