不同提取方法對虎杖中蒽醌類成分及其抗氧化活性影響的研究

1、不同提取方法對虎杖中蒽醌類成分及其抗氧化活性影響的研究【摘要】目的研究不同提取方法對虎杖蒽醌類成分及其抗氧化作用的影響。方法采用回流、索氏、微涉及超聲四種提取方法，測定四種提取液中的游離蒽醌和總蒽醌的含量；采用DPPH，F(xiàn)RAP兩種方法測定其抗氧化活性，并分析蒽醌類成分和抗氧化活性之間的關(guān)系。結(jié)果在對游離蒽醌的測定中以索氏法為最高0.53%，其次為超聲0.45%，各種方法之間相比差異顯著P0.05；在對總蒽醌的測定中，結(jié)果如下：索氏1.16%超聲1.15%微波1.04%回流0.80%；抗氧化活性測定發(fā)現(xiàn)，以回流液的抗氧化才能最強(qiáng)，其次是微波，二者與超聲和索氏的相比有顯著性差異P0.05；相關(guān)性

2、分析發(fā)現(xiàn)，蒽醌的含量與抗氧化活性呈顯著的負(fù)相關(guān)(P0.01)。結(jié)論不同提取方法影響虎杖蒽醌類成分和抗氧化活性，蒽醌類成分和抗氧化活性之間具有負(fù)相關(guān)的關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】提取方法；虎杖；蒽醌；分光光度法；抗氧化Abstrat:bjetiveTexplretheeffetfdifferentextratinethdsnthententfanthrquinnepundanditsantixidativeativityinPlygnuuspidatuSieb.etZu.ethdsAnthrquinnepundasextratedrespetivelybyrefluxethd,Sxhletextratine

3、thdultrasundaveethdandirave-assistedextratin.Thefreeandttalanthrquinnententanditsantixidativeativityasdeterinedbyspetrphtetry.Therrelatinbeteenanthrquinnepundandantixidativeativityasanalyzed.ResultsThereeresignifiantdifferenesintheextratinntentffreeanthrquinnententangthefurextratinethdstatedP0.05,Sx

4、hletextratinethdasthehighest0.53%，ultrasundaveethdasbetter0.45%.Inthedeterinatinfttalanthrquinne,theresultas:Sxhletextratinethd1.16%ultrasundaveethd1.15%irave-assistedrefluxethdextratin.Therefluxethdasbetterthanirave-assistedextratin,paredithSxhletextratinethdandultrasundaveethd.Thereeresignifiantdi

5、fferenesinthedeterinatinfitsantixidantativityP0.05Thereassignifiantnegativerrelatinbeteenanthrquinnepundanditsantixidativeativity(P0.01).nlusinAnthrquinnepundandantixidativeativityinPlygnuuspidatuSieb.etZu.asaffetedbydifferentextratingethds,thereasnegativerrelatinbeteenanthrquinnepundandantixidative

6、ativity.Keyrds:Extratinethd;PlygnuuspidatuSieb.etZu.;Athrquinnepund;Spetrphtetry;Antixidativeativity虎杖系蓼科蓼屬植物虎杖PlygnuuspidatuSieb.etZu.的根莖和根，具有抗菌、抗病毒等廣泛的治療作用1。其主要有效成分為蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類等。隨著近年來對其藥理作用的深化研究，虎杖的抗氧化作用也日益為人們所重視2，3。蒽醌類成分作為虎杖中主要有效成分，在治療疾病過程中起著較為重要的作用，本實(shí)驗(yàn)主要研究了不同提取方法對虎杖中蒽醌類成分及其抗氧化作用的影響，并分析蒽醌類成分和抗氧

7、化活性之間的關(guān)系。1儀器與材料1.1儀器1.2材料大黃素對照品中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110756200110，供含量測定用，經(jīng)歸一化法標(biāo)定98.0%；二苯代苦味?；杂苫?1，1-pheny-2-pirylhydrazyl，DPPH)Siga；TPTZ2，4，6-tripyridyl-s-trizineSiga；虎杖藥材購自河南仟僖堂醫(yī)藥公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院曹繼華教授鑒定為正品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2方法2.1對照品溶液的制備精細(xì)稱取大黃素對照品(105枯燥至恒重)4.1g，置50l量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精細(xì)汲取上述溶液1l，置10l量瓶中，加0.5%醋酸鎂-甲醇溶液至刻度

8、，作為對照品溶液。2.2樣品的前處理將虎杖經(jīng)過枯燥，采用微型植物試樣粉碎機(jī)進(jìn)展粉碎，過60目篩，粉末經(jīng)恒溫60)枯燥24h后，放枯燥器中，備用。2.3供試品溶液的制備2.3.1回流提取液的制備精細(xì)稱取2.2項(xiàng)下樣品約0.5g，置50l的圓底燒瓶中，加70%的乙醇回流提取3次，提取時(shí)間分別為1.5，1，1h，乙醇用量分別為20，15，15l，合并3次回流提取液，定容至100l的容量瓶中，備用。2.3.2索氏提取液的制備精細(xì)稱取2.2項(xiàng)下樣品約0.5g，采用70%乙醇進(jìn)展索氏提取，提取至無顏色為止約6h，提取液定容至100l的容量瓶中，備用。2.3.3超聲提取液的制備精細(xì)稱取2.2項(xiàng)下樣品約0.5

9、g，置50l的三角瓶中，70%的乙醇超聲提取3次，3in/次輻射時(shí)間為10s/次，間隙10s，工作18次，乙醇用量分別為20，15，15l。合并3次的超聲提取液，定容置100l的容量瓶中，備用。2.3.4微波提取液的制備精細(xì)稱取2.2項(xiàng)下樣品約0.5g，置50l的三角瓶中，70%的乙醇微波提取，提取3次，1in/次，工作時(shí)間為10s/次，間隙60s，工作6次，乙醇用量分別為20，15，15l。合并3次的微波提取液，定容置100l的容量瓶中備用。2.4蒽醌百分含量的測定2.4.1游離蒽醌百分含量的測定分別精細(xì)汲取2.3項(xiàng)下各供試品溶液10l，水浴上蒸干，再加20l蒸餾水溶解，加氯仿萃取3次20，

10、15，15l，合并3次氯仿萃取液，定容至50l的容量瓶中，精細(xì)汲取15l，水浴上蒸去氯仿，殘?jiān)?.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解，定容至10l的容量瓶中，搖勻，放置20in。以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白，測定其在510n處吸光度值。2.4.2總蒽醌百分含量的測定分別精細(xì)汲取2.3項(xiàng)下各供試品溶液10l，水浴上蒸干，加2.5l/L的硫酸20l水解2h，稍冷，加氯仿20l繼續(xù)水解2h。放置至室溫后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)，并用氯仿洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，分取氯仿層置100l的容量瓶中，酸水層繼續(xù)用氯仿萃取3次20，15，15l，并入上述100l的容量瓶中，精細(xì)汲取30l，蒸餾水洗至中性，置水浴上揮干氯

11、仿層，殘?jiān)?.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解，定容至10l的容量瓶中，搖勻，放置20in。以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白，測定其在510n處吸光度值。2.5抗氧化活性的測定2.5.1總抗氧化才能的測定5取2.3項(xiàng)下各供試品溶液，適當(dāng)稀釋后移液器取100l，參加FRAP工作液300l/L醋酸鹽緩沖液，10l/LTPTZ，20l/LFeL33l，混勻反響20in，于593n處讀取吸收度，以FeS4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化才能以FRAP值表示：1FRAP單位=1l/LFeS4，即樣品的抗氧化才能相當(dāng)于FeS4的l/L數(shù)。2.5.2去除自由基才能的測定6取2.3項(xiàng)下各供試品溶液，適當(dāng)稀釋后移

12、液器取100l，參加2l0.2l/LDPPH的乙醇溶液，混合均勻，黑暗下室溫避光反響20in，在517n處測定吸光度，同時(shí)以2lDPPH+100l緩沖溶液混合后的吸光度為空白組，計(jì)算去除率/%=1藥品組A517/空白組A517100%。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.6系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)2.6.1測定波長的選擇取大黃素對照品適量，用0.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解，在360600n波長間進(jìn)展掃描，發(fā)現(xiàn)大黃素在510n處有最大吸收峰，應(yīng)選510n作為檢測波長。見圖1。2.6.2線性關(guān)系考察精細(xì)稱取大黃素對照品(105枯燥至恒重)4.1g，置50l量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。精細(xì)汲取0.4，0.6，0.8，1

13、.0，1.2，1.6，2.0l，分別置于10l量瓶中，加0.5%醋酸鎂-甲醇溶液至刻度，放置20in。以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白，分別測定溶液在510n處的吸光度。以吸光度對濃度進(jìn)展線性回歸，得到回歸方程：Y=0.0443X+0.0137，線性范圍為3.2816.4g/l，r=0.999。2.6.3精細(xì)度實(shí)驗(yàn)取2.1項(xiàng)對照品溶液，重復(fù)測定5次，測得的吸光值RSD為1.3%n=5。2.6.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取虎杖5份，按2.3.3項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制備，并依2.4項(xiàng)下的方法分別測定游離蒽醌和總蒽醌的吸光值，測得的吸光值RSD分別為2.3%，2.8%n=5。2.6.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精細(xì)稱取大黃

14、素對照品和虎杖適量，按2.1和2.3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按2.4項(xiàng)下的方法測定，每間隔20in測定吸光度，共測6次，結(jié)果吸光值的RSD分別為0.6%，1.2%，說明大黃素和虎杖樣品的吸收度值在2h內(nèi)根本穩(wěn)定。2.6.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)精細(xì)稱取上述含量的虎杖粉末約0.1g，參加82g/l大黃素甲醇溶液1l，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定回收率，結(jié)果平均回收率為97.2%，RSD=2.3%n=5。2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)展顯著性分析，多重比擬采用Dunan檢驗(yàn)，以提取方法為控制因素進(jìn)展相關(guān)分析，Exel作圖。3結(jié)果3.1不同提取方法對虎杖中游離蒽醌含量的影響

15、4種提取方法對虎杖中游離蒽醌的提取含量見圖2，從圖2中可以看出以索氏提取法為最高，百分含量為0.53%，其次為超聲提取，含量為0.45%，微波法為0.25%，回流法為0.12%，并且各種提取方法之間相比差異顯著P0.05。3.2不同提取方法對虎杖中總蒽醌含量的影響不同提取方法對虎杖中總蒽醌含量的影響見圖3，在圖3中可以看出，對總蒽醌的測定中，索氏提取值為最高，百分含量到達(dá)1.16%，超聲提取僅次于索氏提取，含量為1.15%，兩者相比沒有顯著性差異P0.05?；亓魈崛》y得總蒽醌百分含量為0.80%，微波提取法為1.04%，這兩種方法與索氏和超聲相比差異顯著P0.05。3.3不同提取方法對虎杖抗

16、氧化才能的影響不同提取方法對虎杖抗氧化才能的影響見圖4。由圖4可知，以回流提取液的抗氧化才能最強(qiáng)，F(xiàn)RAP值為214，其次是微波提取液，F(xiàn)RAP值為195，這兩種提取液的抗氧化才能相比差異不顯著P0.05，但與超聲和索氏的相比有顯著性差異P0.05，超聲提取液的FRAP值為104，索氏提取液的為90，超聲與索氏提取液的抗氧化才能相比無顯著性差異P0.05。3.4不同提取方法對虎杖去除自由基才能的影響不同提取方法對虎杖去除自由基才能的影響。見圖5，由圖5可以看出以回流提取液的去除自由基才能最強(qiáng)，自由基去除率到達(dá)63%，其次是微波提取液，到達(dá)57%，這兩種提取液的抗氧化才能相比差異不顯著P0.05

17、，超聲與索氏提取液的去除自由基才能分別為32%，27%，二者相比無顯著性差異P0.05，回流和微波提取液的抗氧化才能與超聲和索氏的提取液相比有顯著性差異P0.05。3.5蒽醌含量與抗氧化活性間的相關(guān)關(guān)系由表1可以看出，經(jīng)相關(guān)性分析后游離蒽醌的含量與總蒽醌的含量有很強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)到達(dá)0.9323P0.01，游離蒽醌與FRAP值和自由基去除率也具有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別到達(dá)-0.9837P0.001，-0.9909P0.001，總蒽醌受到游離蒽醌的影響也與FRAP值和自由基去除率具有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.8902P0.01，-0.8950P0.01。表1游離、總蒽醌與抗氧化活

18、性的相關(guān)關(guān)系略4討論4.1對蒽醌類成分的顯色，常用的顯色劑為NaH，KH，5%NaH-2%NH4H及醋酸鎂甲醇溶液。由于前幾種顯色反響所呈顏色對光及氧不穩(wěn)定，而且其所呈顏色最大吸收由500518n不等，影響吸收度的測定4。筆者曾采用NaH作顯色劑，但不及醋酸鎂-甲醇顯色穩(wěn)定，且醋酸鎂反響所呈顏色為紅色，雜質(zhì)干擾少。而且其所呈顏色最大吸收在510n左右，且顯色20in以后吸收度趨于平穩(wěn)，因此測定應(yīng)在20in2h內(nèi)完成。4.2對總蒽醌成分的測定，酸水解以后，參加氯仿進(jìn)展兩相水解較單純的酸水解以后氯仿萃取效率較高，因此本實(shí)驗(yàn)采用首先酸水解2h，參加氯仿繼續(xù)水解2h的方法，總蒽醌的提取效率增加8%左右

19、。另外，萃取后的氯仿層必須用蒸餾水水洗至中性，否那么，會(huì)大大影響參加醋酸鎂-甲醇以后的吸收度，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。4.3有效成分的溶出通過潤濕浸透解吸溶解擴(kuò)散的途徑，而提取過程中的外力作用造成外表及細(xì)胞組織的破壞，可進(jìn)步組分的溶出程度，并使溶出過程加速。本實(shí)驗(yàn)采用超聲細(xì)胞破碎提取器進(jìn)展提取，和一般的超聲清洗器相比，功率較高，細(xì)胞破碎程度較高，而且，本方法是將超聲探頭深化到提取液內(nèi)，因此提取時(shí)間短，效率高，但與索氏提取相比，因提取次數(shù)較少，殘?jiān)锌赡軞埩羯倭坑行С煞?，因此結(jié)果偏低，筆者也曾采用提取4次，5次等方法，結(jié)果增加3.0%，5.1%，但考慮提取藥物一般采用提取3次的方法，另外為和回流、微波等方法平行，因此仍然使用提取3次的提取液。4.4從整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，索氏提取對游離蒽醌和總蒽醌，提取效率最高，但耗時(shí)長達(dá)6h，超聲處理僅需3in。微波提取所得提取液的游離蒽醌百分含量為0.26%，較低，可能是操作時(shí)間較短所致，因微波操作過程采用70%乙醇作溶劑，家用微波爐進(jìn)展提取，功率較高，加熱10s，即需較長的時(shí)間冷卻，否那么，容易暴沸，因此提取時(shí)間較短，詳細(xì)是否為此原因，有待進(jìn)一步證實(shí)。4.5FRAP法其原理是基于氧化復(fù)原反響，在較低的pH值下Fe3+與TPTZ形成復(fù)合物Fe3+-TPTZ，在復(fù)原物質(zhì)的作用下，復(fù)合物被復(fù)原為二價(jià)鐵的形式