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文檔簡介
1、喘復(fù)康合劑對支氣管哮喘大鼠氣道重塑和CD44表達(dá)的影響【摘要】目的觀察喘復(fù)康合劑對支氣管哮喘大鼠氣道重塑的影響及其可能的作用機(jī)制。方法采用卵白蛋白致敏法復(fù)制大鼠哮喘模型,以喘復(fù)康合劑灌胃給藥后,用免疫組織化學(xué)法檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中D44表達(dá)的變化;通過圖像分析系統(tǒng)測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠支氣管壁各層的厚度;通過assn三色染色法及圖像分析系統(tǒng)測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠膠原沉積厚度。結(jié)果哮喘組肺組織中D44的含量明顯高于對照組P0.05,4周組較3周組更為明顯;激素組D44表達(dá)不明顯,與對照組相比無顯著性差異P0.05。喘復(fù)康低、高劑量組D44的含量明顯低于哮喘組P0.05。圖像分析結(jié)果顯示,哮喘組支氣管平滑
2、肌明顯增厚,膠原沉積增加,4周組較3周組更為明顯,與對照組比擬有顯著性差異P0.05,激素組與喘復(fù)康組平滑肌增厚不明顯,與對照組相比無顯著性差異P0.05。結(jié)論喘復(fù)康合劑可以抑制哮喘大鼠氣道重塑的形成,可能是通過減少肺組織中D44的產(chǎn)生和表達(dá)而發(fā)揮的,與激素作用結(jié)果相似?!娟P(guān)鍵詞】哮喘氣道重塑喘復(fù)康大鼠Abstrat:bjetiveTrytbservetheeffetandpssibleehanisfhuanFuKangixturenairayredellfratdelsfastha.ethdsAnanialdelfasthaasestablishedbyVA(valbuin)sensitiz
3、ing-hallengingSDrat.aterextratfhuanFuKangeregiventrats(ig).IunhistheialtehnlgyasusedtestiatethehangefD44intheratlungtissuesfeahgrup,thethiknessfbrnhialallandtheareafllagendepsitinasdetetedbyputeriageanalysesysteandbyethdfassntrihrestaining.ResultsThententfD44flungtissuefasthagrupassignifiantlyhigher
4、thanthatfntrlgrup(P0.05),thefur-eekgrupasrebviusthanthethree-eekgrup.ThententfD44fldseandhighdsegrupasbviuslylerthanthatfasthagrup(P0.05).Theresultsftheiageanalysisshedthatthethiknessfbrnhialsthusleandtheareafllagendepsitinbviuslyinreased,thefur-eekgrupasreevidentthanthethree-eekgrup,thereassignifia
5、ntdiffereneparedithntrlgrup(P0.05).ThesehangesfhrnegrupandhuanFuKanggruperentevident,thereasnsignifiantdiffereneparedithntrlgrup(P0.05).nlusinhuanFuKangixtureaninhibitetheairayredelingbyreduingtheprdueandtheexpressinfD44inasthatiratlungtissue.Keyrds:Astha;Airayredeling;huanFuKangRats支氣管哮喘(簡稱哮喘)是嚴(yán)重影響
6、人體安康的慢性呼吸道炎癥性疾玻近年來,人們針對哮喘病的慢性進(jìn)展性和難以根治性,對于哮喘氣道壁重塑的研究日益受到重視。氣道重塑主要表現(xiàn)為氣道平滑肌肥大、增生、基底膜增厚和玻璃樣變,由此可致氣道的不可逆阻塞和持續(xù)的氣道高反響性,是頑固性哮喘的重要病理根底1。許多因素如炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及原癌基因都參與了這一過程。本研究觀察不同時段哮喘大鼠模型肺組織中D44的表達(dá)及藥物對其表達(dá)的影響,旨在進(jìn)一步說明D44在哮喘氣道重構(gòu)中的作用和藥物的干預(yù)機(jī)制,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供根據(jù)。1材料與方法1.1藥品與試劑雞卵清白蛋白VA,美國Siga公司;地塞米松磷酸鈉注射液,湖北天藥藥業(yè);兔抗鼠D44多克隆抗體、即用型
7、SAB免疫組化染色試劑盒,武漢博士德生物工程;SP免疫組織化學(xué)、DAB顯色試劑盒,北京中衫金橋生物技術(shù)。1.2儀器402T型超聲霧化器,上海四菱醫(yī)療器械廠;自制大鼠霧化吸入箱;D200圖象采集系統(tǒng)、I50型圖像采集軟件、Iage-Prplus真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析軟件,德國LEia公司產(chǎn)品等。1.3動物及分組安康雄性SD大鼠80只,體重180200g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)前動物于正常溫控、光照和自由攝取食物、水的條件下飼養(yǎng)1周后,被隨機(jī)分成5組:正常對照組、哮喘組、地塞米松處理組及喘復(fù)康低劑量和高劑量處理組。各組又分成誘喘3周、4周兩個時間段。1.4大鼠哮喘模型的建立采用
8、卵白蛋白VA致敏法制備2。第1天,哮喘組及各給藥組大鼠用1l混懸液腹腔注射VA10g;Al(H)3干粉100g致敏,第15天開場誘喘,哮喘組大鼠超聲霧化1%VA激發(fā),約30in/次,觀察并記錄大鼠呼吸及全身情況,以出現(xiàn)呼吸加快、口周發(fā)紺及腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸為激發(fā)成功,共2128d。分別于第35天,第42天處死大鼠。地塞米松組于每次誘喘前1h給予腹腔注射地塞米松1.0g/kg。對照組在一樣的時間腹腔注射、霧化吸入0.9%生理鹽水,其余同哮喘組。喘復(fù)康處方藥物由醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科提供,其主要成分為麻黃、杏仁、丹參、僵蠶、地龍、蘇子、白芥子、魚腥草、黃藤、甘草等。所有藥物經(jīng)浸泡、煎熬、過濾及濃縮成濃度為
9、4g生藥/l的藥汁,將濃縮后的藥汁裝入已消毒的容器中,密封后再高溫滅菌,置于4冰箱保存用。于霧化攻擊前給予灌胃給藥,低高劑量組分別以50,100g生藥/(kgd)灌胃。1.5肺組織病理學(xué)觀察末次激發(fā)完畢后24h內(nèi)處死,取右肺中葉組織,修塊,10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋切片。行HE染色及assn三色法染色。1.6計(jì)算機(jī)圖象分析氣道壁厚度及膠原厚度采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng),每張切片在顯微鏡下(400),確定完好的支氣管橫截面,分別選取6個完好的細(xì)支氣管截面,分別測取支氣管基底膜周徑Pb、總管壁面積At、內(nèi)壁面積Ai以及平滑肌面積A,并用Pb將測量值標(biāo)化,分別以at/Pb、ai/Pb及a/Pb代表
10、相應(yīng)管壁層的厚度,并計(jì)算其平均值。assn三色染色法使膠原纖維呈綠色,IG-Q500圖像采集系統(tǒng)采集圖像,找到完好的支氣管橫截面,圖像分析膠原厚度。1.7免疫組織化學(xué)染色D44免疫組化染色采用SAB法。切片脫臘、水化后3%H22室溫下反響10in以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復(fù)抗原,滴加正常牛血清封閉液,室溫10in。滴加適當(dāng)稀釋1100的一抗免抗鼠D44多克隆抗體,4下過夜,PBS充分沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG,37下反響20in,滴加試劑SAB,37下反響20in后DAB顯色,鏡下控制反響時間,蒸餾水充分洗滌。蘇木精輕度復(fù)染,脫水、透明、封片觀察。計(jì)算機(jī)圖象半定量分析系統(tǒng)測取管壁陽性
11、染色的灰度值作相對含量,隨機(jī)選取6個支氣管,圖像分析各支氣管細(xì)胞染色的灰度值。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組間數(shù)據(jù)均以(s)表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析,各組間比擬首先采用方差齊性檢驗(yàn),組間差異采用單因素方差分析及q檢驗(yàn),相關(guān)性檢驗(yàn)采用直線相關(guān)分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1病理組織學(xué)改變各組肺組織石蠟切片常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn),哮喘3周組,支氣黏膜皺襞增多,上皮脫落,氣道平滑肌的厚度明顯增加,黏膜下、管壁及肺泡間質(zhì)均見有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,管腔狹窄;4周組上述改變更加明顯。激素組和喘復(fù)康合劑組僅有輕度的炎癥反響,支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤明顯輕于哮喘組。as
12、sn三色法染色法結(jié)果顯示,哮喘組支氣管黏膜及上皮下膠原纖維呈綠色,其分布明顯增多,4周組較3周組更為明顯;激素組和喘復(fù)康合劑組上皮下基底膜膠原沉積不明顯,與正常對照組相比無顯著性差異。見圖110。圖1D44免疫組化染色空白對照20略圖2正常組D44免疫組化染色20略圖3哮喘3周組D44免疫組化染色20略圖4哮喘4周組D44免疫組化染色20略圖5地米3周組D44免疫組化染色20略圖6地米4周組D44免疫組化染色20略圖7低劑量3周組D44免疫組化染色20略圖8低劑量4周組D44免疫組化染色20略圖9高劑量3周組D44免疫組化染色20略圖10高劑量4周組D44免疫組化染色20略2.2各組平滑肌面積
13、及厚度、膠原厚度比擬用支氣管基底膜周徑標(biāo)化總管壁面積、內(nèi)壁面積和平滑肌面積為At/Pb,Ai/Pb及A/Pb,代表相應(yīng)管壁層的厚度。哮喘模型組支氣管平滑肌明顯增厚,膠原沉積增加,4周組比3周組更為明顯,與正常對照組及各給藥組比擬有顯著性差異。激素組及喘復(fù)康大劑量組平滑肌增厚不明顯,與正常對照組相比無顯著性差異。見表1。表1各組不同時期平滑肌和膠原厚度比擬略與正常對照組比擬,P0.05,與哮喘模型組比擬,P0.05;n=82.3氣道壁D44免疫組織化學(xué)表達(dá)改變氣道壁D44主要表達(dá)在氣道黏膜上皮細(xì)胞胞膜,炎性細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、支氣管平滑肌未見表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示,D44在正常對照組氣
14、道壁弱陽性表達(dá),激發(fā)3周時,在哮喘模型組氣道黏膜上皮穩(wěn)定陽性表達(dá),4周時表達(dá)更為明顯。在喘復(fù)康小劑量3周干預(yù)組其表達(dá)低于哮喘模型組但無顯著性差異(P0.05),與正常對照組、喘復(fù)康大劑量干預(yù)組、激素干預(yù)組比擬均偏高(P0.05);激素干預(yù)組及喘復(fù)康大劑量組D44表達(dá)明顯較哮喘模型組低(P0.05)。見表2。2.4相關(guān)性分析經(jīng)直線相關(guān)分析得知,氣道壁D44含量與平滑肌厚度呈顯著正相關(guān)r=0.741,P0.01,與膠原厚度也呈顯著正相關(guān)r=0.774,P0.01。表2各組不同時期肺組織D44免疫組化學(xué)定量分析結(jié)果略與正常對照組比擬,P0.05,與哮喘模型組比擬,P0.05;n=83討論研究發(fā)現(xiàn),細(xì)
15、胞黏附分子中糖蛋白及其黏附機(jī)制可能是介導(dǎo)哮喘時炎性細(xì)胞浸潤、增殖乃至纖維化形成的分子基矗D44是一種細(xì)胞外表跨膜糖蛋白分子,屬于未分類的黏附分子,通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性黏連,刺激多種細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成,而具有增高氣道反響性、促使氣道重塑發(fā)生的作用,與哮喘的發(fā)病親密相關(guān)3。Kath等4通過在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D44單克隆抗體(K201或I7)可以顯著減少嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集,提示白細(xì)胞特別是嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向肺部炎癥組織趨化浸潤有賴于D44分子參與,并且通過炎癥細(xì)胞的破壞和分解導(dǎo)致部分損傷,進(jìn)而引起上皮和基底的破壞和萎縮,直至重塑形成。hkaara等5報(bào)道致
16、敏哮喘大鼠BALF中的嗜酸粒細(xì)胞明顯增加,可能是通過D44-HA途經(jīng)實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)化生長因子1TGF-1是哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子,其具有促膠原產(chǎn)生、增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡等重要作用6。D44可通過介導(dǎo)炎性細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量TGF-1,喘復(fù)康合劑可能通過減少氣道壁TGF-1的表達(dá)而抑制氣道重塑。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠VA致敏的哮喘模型,測定了致敏不同時段肺組織中D44表達(dá)量的變化,觀察哮喘不同時段支氣管肺組織的組織學(xué)改變及基底膜膠原沉積情況,并觀察比擬應(yīng)用中藥合劑喘復(fù)康以及激素治療對于氣道重塑的影響。喘復(fù)康由我校中醫(yī)內(nèi)科提供,是根據(jù)臨床經(jīng)歷總結(jié)和改進(jìn)的治療哮喘的方劑。支氣管哮喘屬中醫(yī)學(xué)中
17、“哮證范疇,哮病的病因多以肺虛、脾虛、腎虛為本,以風(fēng)、寒、濕、痰、熱、淤為標(biāo)。方中甘草、麻黃具有松弛支氣管平滑肌作用;地龍通過抗組織胺作用而擴(kuò)張支氣管;杏仁、蘇子、白芥子、僵蠶等具有祛痰降氣作用,減輕肺氣壅塞,使呼吸較通暢而有助于止喘、降低氣道反響性。諸藥合用補(bǔ)益肺、脾、腎,調(diào)理臟腑氣機(jī),恢復(fù)升降功能,共同到達(dá)扶正、化痰、平喘的成效。但其解痙平喘的有效成分和分子機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。同時,喘復(fù)康合劑可通過減少哮喘時肺組織中D44的表達(dá),抑制或減輕氣道平滑肌的增厚及膠原的沉積,從而防止氣道重塑。但其詳細(xì)作用于D44表達(dá)的哪個環(huán)節(jié)及其如何發(fā)揮抑制它們表達(dá)的作用還有待進(jìn)一步研究?!緟⒖嘉墨I(xiàn)】1趙順英.哮喘發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展J.實(shí)用兒科臨床雜志,2022,1810:768.2呂國平,崔得健,郭英江,等.介紹一種建立大鼠哮喘模型的實(shí)驗(yàn)方法J.中華結(jié)核病和呼吸雜志,1995,18(6):372.3arER.D44-astikytargetfrasthaJ.linInvest,2022,111(10):1460.4Ka
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