靶向血管緊張素Ⅱ受體基因的短發(fā)夾RNA的功能比較

1、靶向血管緊張素受體基因的短發(fā)夾RNA的功能比擬邱齡，肖傳實，曾秋棠，李茂蓮【關鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素受體；載體GenesileningtargetedttheratAT1reeptrsbyeffiientshRNAsanditssreening【Abstrat】AI:TinvestigatetheeffiayfshrthairpinRNAs(shRNAs)tdulatetheexpressinfratangitensintype1(AT1)reeptrgeneinaalianellsandtexplretherrelatinsbeteenthefeaturesfeffiients

2、hRNAsandshRNAsfuntinality.ETHDS:egenerated4shRNAsexpressinvetrstargetingagainstratangitensinreeptrs.TheshRNAseretargetedt4differentreginsfthesaegene.Therat6gliaellseretransfetedithnstrutedpGenesil1shRNAplasidandsrabledplasid.TheulturedellserelletedatdifferentphasesfrRTPRandesternbltanalyses.RESULTS:

3、24hlater,nsignifiantredutininAT1RNAlevelsatalltreatedgrupsuldbedeteted.48hlater,AT1RNAlevelfPbtreatedgrupdrpedt(55.77.6)%fthatinntrlgrup,andreahedthEirlestpintafter72h(43.78.2)%.NsignifiantinhibitinfAT1reeptrRNAexpressinasfundinthergrups(P0.05).TheAT1RNAandprteinlevelsbehavedultiatelysiilarly.Athur2

4、4and48,theAT1prteinas(46.94.2)%and(37.03.7)%respetivelyparedtntrlandaaxiuredutinasbservedafter72hinubatin(28.14.0%paredtntrls).NLUSIN:Besidessegeneralrules,ebelievethatthelpstrutureintheRNAattheregintargetedbysiRNAandthebetteraessibilityfthesiRNAttargetedRNAdhaveastrngeffetnsilening.【Keyrds】RNAi;hyp

5、ertensin;angitensinreeptr;vetr【摘要】目的：研究哺乳動物細胞中shRNA調節(jié)大鼠血管緊張素1型受體基因表達的有效性并探究有效shRNA的特征與shRNA功能性之間的關系.方法：設計并構建四個靶向大鼠AT1受體基因不同區(qū)域的shRNA表達載體，轉染大鼠神經(jīng)膠質瘤6細胞，并在不同時相搜集轉染的細胞，進展RTPR和esternblt檢測.結果：轉染24h之后，各處理組均未見AT1RNA程度有明顯減少.與對照組相比，Pb組在轉染后48h血管緊張素受體RNA基因程度下降到55.77.6%，72h后到達最低點43.78.2%.其它組AT1受體RNA表達無明顯抑制(P0.05)

6、.抑制大鼠血管緊張素受體RNA基因及其蛋白的結果類似.與對照組相比，Pb組血管緊張素受體蛋白在24h和48h分別減少至46.94.2%和37.03.7%，最大減少在轉染后72h28.14.0%.結論：選擇有效的shRNA序列時，除了一般的原那么之外，靶位RNA的環(huán)狀構造及siRNA是否能到達靶位對基因干擾實驗能否成功具有重要作用.【關鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素受體；載體基因干擾RNAinterferene可以特異性地靶向降解目的基因RNA，從而使組織或細胞中的靶基因表達減少或沉默1.在本實驗中，我們采用RNAi技術，擬靶向降解大鼠神經(jīng)膠質瘤6細胞中的血管緊張素1型受體AT1R的RNA

7、，選取并合成了多條編碼大鼠AT1RRNA的短發(fā)夾RNAshRNA的核苷酸單鏈，退火形成雙鏈構造并將其克隆進入質粒載體，在構建完成四條編碼AT1RshRNA的表達載體之后，轉染6細胞.根據(jù)不同核苷酸序列shRNA質粒在哺乳動物細胞內的功能表達，研究核苷酸序列及堿基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差異，探究挑選有效shRNA的原那么.1材料和方法11材料載體pGenesil1質粒購自武漢市晶賽生物工程技術，限制性核酸內切酶BaH，Hind，Sal，Pst購自大連寶生物工程;T4DNA連接酶及緩沖液購自NeEnglandBilabs公司;大鼠神經(jīng)膠質瘤細胞株6細胞購自中國典型物保藏中心;

8、細胞培養(yǎng)液DE購自Hylne公司;轉染試劑etafetaine購自德國Bitex公司.所有的DNA合成及引物合成效勞均由上海博亞生物技術提供.12方法121靶基因AT1RRNA的shRNA的構建在GenBank上選取大鼠AT1R的基因序列序列號N_030985，利用網(wǎng)上設計軟件siRNATargetFinder，選取siRNA以堿基TT結尾、長度為21個核苷酸的序列，并且G含量最大不超過60%，剔除含有連續(xù)四個或四個以上的A或T堿基的核苷序列，并通過BLAST驗證的靶基因核苷酸序列四條，化學合成編碼shRNA序列的DNA前向和反向序列單鏈如下：靶基因核苷酸序列同時設計一對非特異性序列作為陽性對

9、照.將合成的shRNA序列退火，與線性化的pGenesil1質粒連接，轉化并提陽性克隆，Pst和Sal酶切和測序鑒定證實.以上不同的靶基因序列質粒分別稱為pGenesilAPa，pGenesilBPb，pGenesilP和pGenesilDPd質粒.122細胞培養(yǎng)及轉染按2108/L密度以一樣的細胞數(shù)接種培養(yǎng)板，過夜至細胞鋪滿50%60%.用etafetaine轉染細胞，按16的比例，根據(jù)試劑提供商的轉染方案進展轉染.123RTPRAT1基因引物序列為：5TGTTTTTTTATATTT3,5TTTGTTGGTTATTTA3，內參GAPDH的引物序列為：5TTAAGGAAGTAAGG3,5TTA

10、GTGGGGTTGT3.反響體積25L包括5LDNA，各引物0.25L，1.5Lgl2，0.25LTaqDNA聚合酶，0.5LdNTP混合物和5L10緩沖液.反響條件:在94退火3in之后，9415s，5515s，7215s進展30個循環(huán).畢后，產(chǎn)物上瓊脂糖凝膠電泳.124esternBlt分析轉染pGensilAT1shRNA質粒和對照質粒之后，不同時相收獲6細胞.PBS液洗滌后，上樣緩沖液溶解細胞.煮沸溶解液10in后，離心，取上清，棄沉淀物.確定蛋白濃度.電泳別離細胞溶解液，轉膜.50g/L脫脂奶封閉后，參加抗AT1抗體11000和抗atin抗體11500室溫下孵育1.5h，再參加二抗抗

11、兔HRP抗體孵育，增強型化學發(fā)光顯色.統(tǒng)計學處理：根據(jù)RTPR和esternBlt分析結果，用圖像處理軟件IageTl3.0測灰度值，并與內參照相比得相對值.用SPSS11.5統(tǒng)計軟件neayANVA進展組間方差分析.顯著性程度為P0.05.2結果21不同shRNA表達質粒靶點及二級構造我們選擇大鼠血管緊張素受體基因RNA序列的部分序列,即556575bp，469488bp，595614bp，663682bp,做為基因沉默靶位圖1.構建了四條堿基序列不同的pGenesilAT1shRNA質粒，預計產(chǎn)生的短發(fā)夾RNA如圖2所示.除在3端缺乏兩個連續(xù)的胸苷之外，AT1shRNA的正義鏈與大鼠AT1

12、基因的RNA序列的靶位基因序列是一樣，反義鏈與靶序列互補.其轉錄產(chǎn)生的RNA，預計可以折疊成短發(fā)夾siRNA.所轉錄出的shRNA在理論上應可裂解靶基因RNA，而經(jīng)重新洗牌的對照質粒所轉錄出的shRNA那么不應對AT1受體基因產(chǎn)生有效的基因沉默效應.22AT1shRNA轉染后AT1RNA程度和蛋白表達轉染四組陽性質粒24h后，各組AT1RNA程度無明顯減少.在48h后與對照組相比，轉染Pb質粒組的AT1RNA表達程度下降到55.77.6%，72h下降到最低點僅為對照組的43.78.2%.轉染重新洗牌的siRNA大鼠神經(jīng)膠質瘤6細胞其AT1受體RNA表達程度無明顯抑制(P0.05).結果提示，P

13、b質粒明顯抑制了AT1受體RNA基因的表達，其它三組質粒抑制AT1受體RNA基因作用不顯著圖3，4.將抑制AT1受體RNA有效的Pb質粒進展esternBlt分析.在24h和48h，AT1蛋白的表達分別為46.94.2%和37.03.7%.與對照組相比，表達減少的最大時相在轉染后的72h僅為對照組的28.14.0%.結果說明，Pb質粒轉染的細胞，AT1蛋白程度下降.而轉染重新洗牌的shRNA質粒和對照組那么并不能減少AT1基因的表達圖5.所有的結果清楚說明，轉染Pb質?？梢砸种艫T1基因的表達.3討論腎素血管緊張素系統(tǒng)其主要的效應分子血管緊張素具有調節(jié)血壓、水鈉平衡、神經(jīng)功能等作用.研究證實，

14、血管緊張素參與了動脈硬化、心肌堵塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理過程.血管緊張素通過直接激活AT1R并間接刺激一些生長因子和細胞因子的釋放，誘導心肌細胞,血管細胞肥厚和增生2.同時也可刺激AT2，激活與AT1相反的生物學效應而導致血管擴張、緩激肽生成增加、抑制纖維化和血管重塑3.本研究構建AT1短發(fā)夾RNA表達質粒，試圖用基因沉默技術抑制哺乳動物細胞的AT1RNA的表達，希望在阻滯AT1受體之后，通過血管緊張素對AT2的作用，到達血管擴張，降低血壓、抑制血管重塑等目的4.實驗結果說明，我們觀測到AT1基因RNA的表達在早期即有減少，而隨著RNA程度的抑制，相應的蛋白也有所減少.結

15、果說明，U6啟動子驅動的shRNA序列可有效地和特異地抑制AT1基因在轉染的6細胞中的表達.因此，通過shRNA的表達，在細胞中抑制與高血壓病理生理相關的AT1基因的表達，有可能成為一種有效的治療方法.目前尚無選擇siRNA序列的共識性意見或標準5.為了優(yōu)化siRNA誘導的基因沉默效率，許多研究小組對寡核苷酸長度、二級構造及siRNA雙鏈的序列特異性進展了研究.普遍認為6，siRNA序列應在靶基因起始密碼子下游100個堿基之后進展選擇，應避開起始密碼子的5或3端非編碼區(qū)選擇siRNA序列.選擇的正義鏈序列應是AAN19TT，其中N代表任何核苷酸，即選擇的siRNA應該有兩個尿嘧啶核苷的3突出末

16、端.并且所選的siRNA的長度應是21個核苷酸.決定RNA干擾研究成功與否的因素還有很多，包括靶位在RNA三級構造中的位置、轉染效率以及雙鏈shRNA的特異性等7-8.在比擬本實驗中設計的四條質粒時我們注意到，其中P和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因RNA二級構造中的核心位置尤其以Pd明顯，這可能是質粒轉染細胞后轉錄產(chǎn)生的短發(fā)夾RNA在與RIS(RNA誘導的基因沉默復合物)結合后無法進入靶RNA裂解部位而導致實驗失敗的原因之一.而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因RNA二級構造中的外表位置，但質粒Pa也無效，分析可能的原因：質粒Pa的G含量偏低可以導致對靶基因RNA的識別效率的減少;與RIS雜交

17、效率的下降.除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Pb質粒裂解靶基因的部分二級構造比質粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氫鍵相對弱于后者的靶位.在這些影響因素中，我們認為最重要的因素是siRNA能否進入靶位，而靶位中RNA的構造是否足夠松散，允許siRNA與RIS復合體進展靶向裂解.總之，在進展短發(fā)夾RNA設計時，除了要遵循如靶序列應位于開放閱讀框，而不能選擇非編碼區(qū)；G含量應在50%左右；避開起始密碼子后至少100個堿基；搜索5AAN19序列并進展BLAST等一些普遍的規(guī)那么9之外，我們認為siRNA能否進入靶裂解部位并且靶位的二級構造是否松散是有效shRNA合理設計并獲得實驗成功的最重要的因素.

18、【參考文獻】1FireA,XuS,ntgeryK,etal.PtentandspeifigenetiinterferenebydublestrandedRNAinaenrhabditiselegansJ.Nature,1998,3916669:806-811.2DinhDT,FrauanAG,JhnstnI,etal.Angitensinreeptrs:Distributin,signalingandfuntinJ.linSi(Lnd)，2001,100(5):481-492.3LevyBI.anAngitensinIIType2reeptrshavedeleteriuseffetsinardivasulardisease?IpliatinsfrtherapeutiblkadefthereninangitensinsysteJ.irulatin,2022,109(1):8-13.4Esler.ThesypathetisysteandhypertensinJ.AJHypertensSuppl,2000,13(6):99S-105S.5adhaR,KaulS,iyagishi,etal.KnhfRNAinterfereneandi